吴锋锋 高宏梁 王国荣 李建有 黄 胜 蒋雪生 李雄峰

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是老年人最常见的关节炎，可引起关节慢性疼痛并可导致残疾。口服非甾体抗炎药可快速缓解早期的症状，但不能明显延缓疾病的进程，且这类药物长期服用有很多不良反应，特别是消化道的不良反应[1]。因此,寻找更加可靠的药物替代方案一直是OA治疗的目标[2]。

祖国医学认为，OA属于“骨痹”、“痹症”等范畴。《素问·上古天真论》 曰：“丈夫……七八肝气衰，筋不能动，天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极”。可见其多因肝肾亏虚、筋脉失养而发病。补肾壮筋汤(BZD)出自清代钱秀昌《伤科补要》，其中熟地黄、山茱萸填精益髓、滋补肝肾，续断、杜仲补肝肾、强筋骨，五加皮、茯苓健脾利湿，青皮理气，白芍、当归补血活血，牛膝补肝肾、强筋骨。诸药合用，起到补益肝肾，强筋壮骨的功效，是我国著名的OA治疗成方。临床试验显示，BZD可显著改善OA患者的症状和体征[3,4]。

然而，BZD作用的分子机制仍不清楚，可能是非常复杂和多方面的。Lin等[5]研究发现，BZD可增强衣霉素 (TM)刺激的软骨细胞活力，抑制由内质网应激介导的TM诱导的SD大鼠软骨细胞凋亡。SRY-box 9(Sox9)基因在软骨发育中起重要作用，是软骨间充质细胞向软骨细胞分化的关键转录因子。此外，它还参与调节软骨细胞分化的各个阶段[6]。先前的研究表明，Sox9的过表达可促进软骨修复[7]。因此，本研究目的是确定BZD是否可通过提高Sox9的表达来保护OA细胞模型中的软骨细胞，并阐明其潜在的机制。

材料与方法

1.材料：4周龄雄性SD大鼠16只，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物许可证号：2017-0008，饲养在浙江中医药大学动物实验中心清洁级(SPF)动物房中，其中4只用于制备BZD含药血清，12只用于分离软骨细胞。其他主要材料：DMEM培养基、澳洲胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；胶原蛋白Ⅱ多克隆抗体(142kDa，Ab34712)、Sox9多克隆抗体 (70kDa，Ab185966)购自英国Abcam公司，稀释度分别为1∶5000和1∶1000；蛋白聚糖Aggrecan单抗(250kDa，NB600-504)购自美国Novus公司，稀释度为1∶100；RT-PCR试剂盒购自美国Promega公司。本研究经浙江中医药大学科研伦理学委员会批准，批准文号2017123。

2.方法：(1)BZD含药血清的制备：BZD是中药饮片，由浙江中医药大学实验室提供，含10味中药，包括熟地黄、山茱萸、续断、杜仲、五加皮、白芍、当归、茯苓、青皮、牛膝，其最终浓度为1g/ml(相当于原料的干重)。BZD(18.5g/kg，相当于成人1次的剂量)连续给药7天(每天2次)。最后1次给药2h后，处死大鼠(n=4)，从颈动脉取血。血样在4℃下凝血2h， 上清液1500r/min离心20min，56℃失活30min，过滤后-80℃保存。(2)软骨细胞分离和培养：从大鼠膝关节软骨中分离、培养软骨细胞(n=12)，并按先前已报道的方法进行鉴定[4]。将软骨细胞先用0.1%胰蛋白酶预消化30min，再用1.5mg/ml的胶原酶Ⅱ消化16h，离心后收集细胞。分离的软骨细胞在10%胎牛血清的培养基中进行培养和传代，同时加入青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml，放在37℃含5%二氧化碳的孵育器中。(3)实验分组：选取第2代(P2)软骨细胞用于实验，因为它们已经被证明是胶原蛋白Ⅱ含量丰富，能表现出典型的软骨细胞形态[3,4]。软骨细胞随机分为3组,即对照组，P2软骨细胞不予任何干预；模型组, IL-1β(10μg/ml)刺激P2软骨细胞24h; BZD组，IL-1β(10μg/ml)刺激P2软骨细胞24h，然后加入BZD含药血清(400μg/ml)。BZD干预72h后收集所有软骨细胞进行分析。(4)软骨细胞活性测定：采用MTT比色法检测BZD对软骨细胞活性的影响。BZD给药72h后，3组细胞中各加入0.5mg/ml MTT溶液，37℃孵育4h，弃上清液,将晶体溶解在100μl二甲基亚砜(DMSO)溶液中。使用酶标仪(美国Hercules公司)在570nm处读取吸光度。(5)Sox9、蛋白聚糖aggrecan、胶原蛋白Ⅱ蛋白水平的测定：采用细胞裂解液(RIPA∶PMSF∶Cocktail =100∶1∶2)于冰上裂解细胞，BCA法检测蛋白浓度。取150μg蛋白经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜上。采用5% BSA室温封闭40min，蛋白一抗冰上过夜孵育，二抗室温孵育60min，采用双色红外激光成像系统采集图像。每组重复3 次。(6)Sox9、蛋白聚糖aggrecan(Acan)、胶原蛋白Ⅱ(Col2a1)基因水平的测定：采用Trizol法提取软骨细胞总RNA，超微量核酸分析仪检测总RNA的浓度与纯度。采用美国Promega公司试剂盒进行荧光定量PCR检测，按照试剂盒说明书操作。反应步骤: 95℃ 5min，95℃ 10s，58℃ 1min，共30个循环。以2-ΔΔCT表示相对表达量。Sox9引物序列：上游引物5′-GCGAGCAGCAGCAGCACTC-3′，下游引物5′-TCTGGTGGTCGGTGTAGTCATACTG-3′。Acan引物序列：上游引物5′-CCAGTCTACCCAGCACCCTA-3′，下游引物5′-TCAGGGACTTGGCTGTTTCT-3′。Col2a1引物序列：上游引物5′-GGCTCCCAGAACATCACCTA-3′，下游引物5′-GCCCTCATCTCCACATCATT-3′。内参基因Gapdh引物序列：上游引物5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

结 果

1. 分离培养的大鼠软骨细胞的形态及其鉴定：倒置显微镜下观察分离培养的原代软骨细胞，结果显示培养9～12h部分细胞贴壁，培养至24h绝大部分细胞贴壁，细胞开始伸展，细胞体积较小，呈多角形，均匀散在生长(图1A)。3天左右细胞汇合成单层铺满整个培养瓶底部。4天左右首次传代后增殖速度加快，隔天可再次传代，呈明显的“铺路石”样(图1B)。传至第6代，细胞呈长梭型，开始老化。第7代后细胞呈梭状平铺，折光差，部分细胞脱落，生长速度减慢，传代周期延长，软骨细胞表型退化。由于Ⅱ型胶原的合成与分泌是软骨细胞维持其分化表型的特定指标。细胞鉴定结果显示，培养的软骨细胞胞质中Ⅱ型胶原的棕黄色颗粒较多，呈强阳性表达，可见典型的软骨细胞形态(图1C)。

2．IL-1β诱导的软骨细胞损伤：对照组表现为基本正常的软骨细胞形态(图2A),模型组出现软骨细胞的肥大和萎缩等软骨细胞损伤的征象(图2B),BZD组软骨细胞形态学的损伤较模型组减轻(图2C)。

3.软骨细胞活性：与对照组比较，模型组中软骨细胞活性显著降低(P=0.000)，BZD组和模型组比较，软骨细胞活性增强(P<0.05)，详见图3。

4.Sox9、蛋白聚糖aggrecan和胶原蛋白Ⅱ的基因和蛋白表达：与对照组比较，模型组Sox9、蛋白聚糖aggrecan和胶原蛋白Ⅱ的基因和蛋白表达水平均显著降低 (P=0.000)。在BZD组, Sox9、蛋白聚糖和胶原蛋白Ⅱ的基因和蛋白表达水平较模型组均显著升高(P<0.05,图4、图5)。

讨 论

关节软骨的破坏和丢失是OA的一个主要特征。软骨细胞是软骨中唯一的细胞，嵌入在广泛的细胞外基质(ECM)中，ECM主要由胶原和蛋白多糖组成，关节软骨中的胶原主要为Ⅱ型，关节软骨的主要蛋白多糖为aggrecan[8]。Sox9是一种转录因子，它对许多软骨细胞ECM基因的表达至关重要，并在软骨细胞分化过程中发挥作用[7]。BZD在中国长期被用于OA患者的治疗，临床研究表明，BZD可改善OA患者的症状[3,4]。然而，BZD在OA中的分子机制尚不明确，研究发现BZD通过刺激SD大鼠的细胞周期进程促进软骨细胞增殖[9]。也有研究表明，补肾壮筋汤可清除氧自由基，促进软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡，抑制滑膜炎症，提高软骨细胞抗异常应力水平[10]。

本研究结果显示，BZD提高了IL-1β诱导的软骨细胞Sox9、蛋白聚糖aggrecan和胶原蛋白Ⅱ的表达, 从而促进软骨细胞的活性。Sox9是一种重要的转录因子，参与多种器官和组织的发育，尤其是软骨形成。值得注意的是，Sox9可转录激活许多软骨特异性结构成分和调节因子的基因[11]。在正常软骨细胞中，Sox9调控蛋白聚糖aggrecan和胶原蛋白Ⅱ的表达[11]。正常的关节软骨依赖于合成和分解细胞因子之间的平衡。IL-1β是促炎性细胞因子和分解代谢的关键因子，导致金属基质蛋白酶的产生、减少胶原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖aggrecan的表达[12]。在最近的研究中，IL-1β被用来建立SD大鼠软骨细胞的细胞OA模型。本研究在IL-1β的影响下，软骨细胞出现Sox9、胶原蛋白Ⅱ和aggrecan的快速减少。重要的是， BZD可缓解IL-1β的作用，进一步支持BZD在 Sox9的信号通路的作用。

综上所述，本研究结果支持使用BZD作为一种有效的药物治疗OA。它可能通过参与关节软骨结构和功能的Sox9及其靶基因的正向调控，刺激细胞增殖。但是，BZD对动物模型和OA患者Sox9信号通路的调控还有待于进一步研究。