孔永奎，杨乾坤，王书亚，靳慧芳，吕先萍

郑州大学第一附属医院输血科 郑州 450052

ABO血型系统是人体重要的组织抗原系统，不仅大量分布在人类红细胞的表面，也广泛存在于组织内皮系统，对于安全输血、移植配型、亲子鉴定等具有重要的临床意义，因此正确鉴定ABO血型至关重要[1]。ABO血型鉴定的经典方法是正反定型血清学试验，但对于一些亚型，血清学通常不能给出确切的结果，顺式AB(cisAB)就是典型的例子[2]。当血清学无法准确判定血型时，则可以通过基因型来进行鉴定。结合近年来分子模拟领域比较热门的同源建模、分子对接等研究方法，再加上细胞体外表达实验，可为深入理解ABO血型GTA/GTB糖基转移酶催化供受体底物的机制，尤其是突变之后的糖基转移酶是如何协调、催化、影响不同的尿苷二磷酸-半乳糖(UDP-Gal)和(或)尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)糖供体加成到H糖链受体上提供帮助。本文结合免疫血液学、分子生物学、生物信息学、细胞生物学实验对1例cisAB03亚型进行了鉴定，以期为揭示相关cisAB亚型分子机制提供思路和方法。

1 对象与方法

1.1研究对象男性患者，31岁，无输血史，于2017年12月在本院门诊常规体检，血型血清学检查发现正反定型不符。

1.2血清学鉴定主要试剂包括单克隆抗-A、抗-B(长春博迅生物技术有限责任公司)，抗-A1、抗-H(荷兰Sanquin公司)，IgM抗-D(珠海贝索生物技术有限公司)，抗-A,B(上海血液生物医药公司)； Ac、Bc、Oc细胞(长春博德生物技术有限责任公司)，血型血清学鉴定和操作步骤参照第3版《全国临床检验操作规程》。

1.3ABO基因的扩增及测序采用北京天根血液基因组试剂盒抽提患者DNA，参照文献[1]建立的方法扩增ABO基因1～7外显子，经酶切纯化后的PCR产物直接作为测序模板，严格按照BigDye试剂盒说明书操作，送上海生工生物工程技术服务有限公司，采用ABI 3730测序仪进行测序。

1.4单倍型分析将PCR产物割胶纯化，用DNA连接酶将第7外显子PCR产物连接到pMD18-T(大连宝生物公司)，转化感受态细胞DH5α，摇菌扩增，抽提质粒DNA进行单倍型分析。

1.5序列的分析和比对采用DNAMAN和Chromas Pro软件进行序列的拼接和比对，ABO等位基因的命名方法参照ISBT血型抗原等位基因数据库。

1.6cisAB03糖基转移酶的同源建模和分子对接采用Modeller 9.18对cisAB03转移酶进行同源建模(模板为1lzj.pdb)，用Gromacs对建模后的蛋白进行能量最小化，然后采用对接软件Autodock将受体H糖链和供体UDP对接到cisAB03转移酶催化区结合口袋，利用Pymol软件对建模和对接结果进行比对、叠加和显示。

1.7体外表达实验利用Stratagene定点突变试剂盒将pcDNA3.1-GTB质粒(瑞金医院蔡晓红主任惠赠)突变为pcDNA3.1-cisAB03(c.700C>T)，然后用Lipofectamine 2000瞬转HeLa细胞，48 h后收集细胞分别与抗-A、抗-B进行凝集反应，倒置显微镜(×400)下观察凝集结果。

2 结果

2.1血清学鉴定结果卡式法室温反应格局显示患者正定型抗-A凝集()，抗-B凝集w+，反定型是A型；采用经典试管法分别在室温和4 ℃反应仍然存在正反不符(表1)，血清学实验表明其表型符合cisAB亚型。

表1 ABO正反定型鉴定结果

2.2ABO基因测序及基因型分析测序结果显示该患者第6、7外显子中存在c.261delG缺失以及c.297A>G、c.526C>G、c.657C>T、c.700C>T、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C、c.930G>A杂合突变(图1)，结合单倍型分析，确定其基因型为cisAB.03/O.01.01。

图1 cisAB.03第6、7外显子杂合突变

2.3cisAB.03与参考序列碱基差异比对将cisAB.03与参考序列A1.01、B.01碱基进行比对，结果见表2。与A1.01相比，存在c.297A>G、c.526C>G、c.657C>T、c.700C>T、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C、c.930G>A突变，除c.700C>T外，其余7个突变可导致A1.01基因变成B.01基因；与B.01相比，cisAB.03发生c.700C>T突变，说明cisAB.03的遗传背景来自于B.01基因。

表2 cisAB.03与参考序列的比对

2.4cisAB03糖基转移酶的同源建模利用Pymol软件将建模和能量优化后的cisAB03(青色)和野生型GTB(灰色)进行叠加比对，可以看出在局部空间结构上二者不能完全叠加(图2A)，说明突变后cisAB03糖基转移酶发生了局部空间构象的改变。图2B和图2C为图2A中红色圆形所示部分放大图。与野生型GTB相比(图2B)，cisAB03上p.Pro234Ser的突变造成了催化区Met266氨基酸空间构象的改变；而Ala268空间构象未见明显改变(图2C)。

2.5cisAB03糖基转移酶的分子对接结果见图3。将H糖链和UDP分子对接到cisAB03糖基转移酶的催化活性区后，可以看出cisAB03糖基转移酶催化活性区“口袋”发生改变并且明显增大，H糖链的朝向和UDP在“口袋”中的构型同样也发生了改变。

2.6cisAB03A抗原和B抗原体外表达实验结果转染pcDNA3.1-cisAB03的HeLa细胞与抗-A呈现()凝集(图4A)，与抗-B呈现w+凝集(图4B)，表明cisAB03转移酶加成UDP-GalNAc到H抗原的能力强于UDP-Gal。

图4 瞬转cisAB03突变的HeLa细胞与抗-A(A)和抗-B(B)的凝集反应结果(×400)

3 讨论

临床发现的ABO亚型常见于正反定型不符的血清学实验，这类亚型的血清学表型可呈现较大的异质性，极易出现错定血型而造成输血风险，因此PCR-SSP或基因测序成为准确鉴定ABO亚型必要的手段。本例cisAB03亚型经由基因测序和单倍型分析确定，由于其中一条等位基因为O.01.01，所以其表型符合cisAB常见的“A强B弱”特点，临床上经由血清学实验易发现其正反不一致；倘若另外一条等位基因是B.01，则会出现弱抗原被掩盖而漏检的可能。作者的课题组[2]曾经报道过1例cisAB01亚型，母亲和新生儿都是ABO*cisAB.01/O.01.01，但是二者在血清学上却呈现出较大的差异，提示即使基因型相同，由于个体表型的异质性，单靠血清学实验很难准确地判断其血型。因此对于正定型凝集强度小于()的疑似亚型的血型，通过基因分型不仅有利于发现亚型或者新等位基因，更能避免错定血型给患者造成的输血风险。

由于cisAB亚型相对于B(A)更为罕见，因此cisAB亚型多为散发或家系报道，目前有学者统计仅有cisAB01亚型相对占比较高(0.66/10万)[3]，而cisAB03则更为罕见，其等位基因分布频率暂时不清[4]。cisAB亚型目前共有11型[5]，根据遗传背景又可以分为两类：一类是以cisAB.01和cisAB.04为代表的5个cisAB等位基因，其是由A1.01基因碱基突变所致；另一类是以cisAB.02和cisAB.03为代表的6个cisAB等位基因，其由B.01基因碱基突变所致。本研究结果显示，cisAB.03相较于B.01，只多了一个c.700C>T突变，其编码的cisAB03糖基转移酶相对于野生型GTB也仅仅多了一个p.Pro234Ser突变，但cisAB03却表现出加成UDP-GalNAc的能力强于UDP-Gal。有学者[6-7]认为，176～235氨基酸的改变主要影响酶的转换数(单位时间内每个催化活性中心所能转化的底物分子数)，而266和268位氨基酸则决定了转移酶的特异性。从本研究cisAB03同源建模结构上可以看到，Ser234在线性序列上靠近转移酶4个特异氨基酸位点(176、235、266、268)的第2个关键位点235，但在空间上却靠近Met266氨基酸位点，因此该位点氨基酸的突变对临近氨基酸空间构象影响极大。cisAB03同源建模显示p.Pro234Ser突变明显影响了Met266位氨基酸的空间构型，表明p.Pro234Ser突变可能很大程度上影响cisAB03糖基转移酶的催化活性和对糖供体特异性识别的能力。

为了分析p.Pro234Ser突变对cisAB03糖基转移酶局部结构的影响，同时也为了进一步验证同源建模的假设，我们将糖供体UDP和配体H糖链对接到cisAB03催化活性口袋区，然后通过Pymol软件的表面显示功能呈现出来，以便更直观地反映p.Pro234Ser突变对cisAB03糖基转移酶结构的影响。在对接时糖供体选用UDP而不是UDP-GalNAc或UDP-Gal主要考虑到化学加成的反应问题。体内真实的酶催化反应伴随基团的水解和转移，但在体外模拟对接时空间结构上较大的UDP-GalNAc和UDP-Gal与酶活性中心原子刚性碰撞，从而不利于精准对接，因此宜选用相对分子质量更小的糖供体“母体”UDP来与H糖链进行对接。对接结果显示，cisAB03糖基转移酶的催化区“口袋”明显增大，酶无法严格区分UDP-GalNAc和UDP-Gal两种糖供体，推测更利于H糖链结合空间构型和相对分子质量较大的UDP-GalNAc而非UDP-Gal，使其在某种程度上对底物具有选择性，从而形成“A强B弱”的血清学表型，同时呈现出双功能酶的活性。细胞体外表达实验也很好地支持了上述分子对接的假设：cisAB03糖基转移酶在HeLa细胞中合成了较多的A抗原及较少的B抗原。然而更有意思的是，虽然B(A)02亚型与cisAB03亚型同为BBBB酶型，仅仅是c.700C>G突变所致的p.Pro234Ala的差异，但B(A)02亚型却更有利于UDP-Gal的结合，呈现出与cisAB03糖基转移酶p.Pro234Ser突变完全相反的局面，这也从侧面说明了GTA/GTB糖基转移酶中234位氨基酸的突变对其局部结构影响的重要性。