吴秋歌,李艳娟,马东波,石 雁,张 辉,汪 洋

1)郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科 郑州 450052 2)新乡市中心医院呼吸与危重症医学科 河南新乡 453000

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是恶性肿瘤细胞侵袭和转移的关键[1]。EMT过程中，细胞上皮源性标记物的表达明显下降，间叶源性标记物的表达增加[2]。上皮标记分子主要有E-钙黏素(E-cadherin)和Desmoplakin等，间充质细胞标记分子主要有波形蛋白(Vimentin)和Fibronectin等[3]。 Snail家族和Twist家族等可以通过与E-cadherin启动子上的E-boxes结合，降低E-cadherin的表达水平[4-5]。 叉头框转录因子C1(forkhead box C1，FOXC1)是FOX家族成员，与动物及人类多种重要器官的发育有关[6]。越来越多的研究[7-9]表明，FOXC1在多种恶性肿瘤组织中高水平表达，增强了肿瘤细胞的转移和浸润能力，如乳腺癌、肝癌及恶性黑色素瘤等。 FOXC1高水平表达的已出现脑转移的乳腺癌患者生存期缩短[7]。FOXC1高表达的肝癌患者术后复发及肺转移发生率更高[10]。该研究中，我们利用siRNA下调人肺腺癌A549细胞中FOXC1的表达，观察细胞中E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表达，以及细胞转移和侵袭能力的改变，探讨FOXC1对肺腺癌细胞浸润、转移的调控作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂A549细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。siRNA-FOXC1和阴性对照siRNA(siRNA-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司。FOXC1、E-cadherin、Vimentin、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。兔抗人FOXC1多克隆抗体购于美国Abcam公司，兔抗人E-cadherin抗体、兔抗人Vimentin抗体及兔抗人GAPDH抗体购于美国CST公司。反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自美国Thermo Fisher公司。Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。

1.2实验分组将A549细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培育。每2～3天传代1次。取对数生长期的细胞，按每孔5×105个/mL接种于6孔板，当细胞融合率达60%～70%时，分3组处理。空白对照组细胞不转染，常规培养；阴性对照组和siRNA-FOXC1组采用脂质体转染技术分别转染siRNA-NC和siRNA-FOXC1。

1.3细胞中FOXC1、E-cadherin及Vimentin mRNA的检测转染处理6 h后，采用实时荧光定量PCR法检测细胞中 FOXC1、E-cadherin及Vimentin mRNA的表达水平。Trizol法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，按照PCR试剂盒说明书操作。FOXC1上游引物：5’-ATCACCCT GAACGGCATCTA-3’，下游5’-CTTGACGAAGCACTCGTTGA-3’；E-cadherin上游引物5’-TGGAGAGA CACTGCCAACTG-3’，下游5’-TTAGGGCTGTGTACGTGCTG-3’；Vimentin上游引物5’-GAAATTGCAGGAGGAGATGC-3’，下游5’-ATTCCACTTTGCGT TCAAGG-3’；内参GAPDH上游引物5’-ACCCA GAAGACTGTGGATGG-3’，下游5’-TTCAGCTCAGG GATGACCTT-3’。反应体系:上、下游引物各1 μL,5×扩增缓冲液5 μL,dNTP 1 μL,模板DNA 0.2 μg,Taq DNA聚合酶0.2 μL,1.5 mmol/L Mg2+1.5 μL,加双蒸水至20 μL。反应条件:预变性95 ℃10 min；变性95 ℃10 s,退火60 ℃20 s；延伸72 ℃15 s；30个循环。用2-ΔΔCt法计算FOXC1、E-cadherin及Vimentin mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.4细胞中FOXC1、E-cadherin、Vimentin蛋白的检测转染处理6 h后，采用Western blot法检测细胞中 FOXC1、E-cadherin及Vimentin蛋白的表达水平。用RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白，用BCA法进行蛋白定量。蛋白经煮沸处理后，经SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜，50 g/L 脱脂奶粉封闭2 h，加一抗(FOXC1、E-cadherin、Vimentin和GAPDH抗体分别按1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 500稀释)4 ℃过夜，用TBST缓冲液于摇床上洗涤细胞5 min×3次，加二抗(按1∶5 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗涤细胞5 min×3次，电化学发光法显色，显影、定影。采用Image J软件分析，以目的条带与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.5细胞侵袭能力的检测转染处理6 h后，采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。将60 μL Matrigel胶用300 mL的无血清培养基稀释，在Transwell小室的上室加入100 μL，放入37 ℃培养箱中孵育4～5 h，直到变成固态。上室中接种1×105个细胞，下室中滴加500 μL含有体积分数20%胎牛血清的培养基培养24 h。取出Transwell小室，用戊二醛固定，结晶紫染色30 min,然后于显微镜下选择4个高倍(400×)视野观察并计数穿膜(侵袭)细胞数。实验重复3次。

1.6细胞迁移能力的检测采用划痕实验。在6孔板底部画出间隔为0.5 cm的两条线。取对数生长期的A549细胞，稀释成1×105个/mL的单细胞悬液，1 mL/孔接种于6孔板培养24 h，然后按1.2分3组处理，24 h后更换为新鲜的完全培养液，继续培养到成单层细胞。用移液器枪头在每孔底部中线处划痕，PBS清洗，继续培养48 h后，显微镜下观察测量划痕宽度并拍照。用Image J软件打开图片后随机选取6条水平线，计算划痕内细胞间距离的均值。迁移率=(1-均值/划痕宽度)×100%。实验重复3次。

1.7统计学处理选用SPSS21.0进行数据分析。3组各指标的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.13组细胞中FOXC1表达的比较见图1和表1。与siRNA-NC组和空白对照组比较，siRNA-FOXC1组FOXC1 mRNA及蛋白表达水平均降低，提示转染有效。

图1 3组细胞FOXC1、Vimentin、E-cadherin 蛋白的表达

表1 3组细胞中FOXC1 mRNA及蛋白表达水平的比较

2.23组细胞中E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表达的比较见图1和表2。与siRNA-NC组和空白对照组比较，siRNA-FOXC1组E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均增高，Vimentin mRNA和蛋白表达水平降低。

表2 3组细胞中E-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表达水平的比较

2.33组细胞迁移和侵袭能力的比较划痕实验结果见图2， 侵袭实验结果见图3。3组细胞迁移率和侵袭细胞数的比较见表3。siRNA-FOXC1组迁移率和侵袭细胞数均较空白组对照组和siRNA-NC组降低。

上：空白对照组；中：siRNA-NC组；下：siRNA-FOXC1组

A：空白对照组；B：siRNA-NC组；C：siRNA-FOXC1组

表3 3组细胞迁移率和侵袭细胞数的比较

3 讨论

肺癌的发病率很高，其中肺腺癌的发病率最高，侵袭和转移是预后差的最主要原因。EMT可以增加肿瘤细胞的转移和侵袭能力，对于肿瘤的发生发展起着重要作用。E-cadherin参与细胞黏附、上皮结构稳定性的维持，并且在促进胚胎组织生长、调节细胞间信息传递等过程中也起着十分重要的作用[11]。多种恶性肿瘤中存在EMT，并且E-cadherin的表达与肿瘤临床分期呈负相关[12]。因此可以认为，E-cadherin低水平表达或缺失是EMT的典型标志[13]。Vimentin主要表达于内皮细胞和一些间质细胞，可介导调控多种细胞活动，参与恶性肿瘤新生血管形成、细胞转移和黏附过程[14-15]，在肿瘤发生及转移过程中发挥一定作用。Vimentin在间质来源的肿瘤细胞内表达，在上皮来源的肿瘤细胞中不表达，在侵袭性肿瘤细胞系中表达增加，其表达与肿瘤的恶性程度有一定的关联[16-17]，Vimentin高水平表达是肿瘤转移和侵袭能力增高的标志之一。

FOXC1基因定位于人类染色体6p25，Hayashi等[11]报道FOXC1可通过不同的通路影响肿瘤细胞的迁移及侵袭。FOXC1可通过激活NF-κB信号通路促使乳腺癌细胞发生EMT，从而导致颅内转移[18]。上调乳腺癌细胞中FOXC1的表达可诱导EMT[19]。本研究发现A549细胞转染siRNA-FOXC1后，Vimentin蛋白及mRNA表达明显下降，E-cadherin的表达增加，细胞的迁移和侵袭能力均降低，提示沉默FOXC1可以在一定程度上抑制A549细胞的EMT，从而进一步抑制A549细胞的迁移和侵袭能力。

综上所述，FOXC1可能通过诱导肺腺癌细胞发生EMT，增强其侵袭和转移能力；抑制FOXC1的表达可以降低肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力。该结论为靶向FOXC1治疗肺腺癌奠定了基础。