徐如飞，金哲晨，许 良，蒋培蓉，陈美雯，孙梅好，蒲首丞,2*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004; 2.浙江华茗园茶业有限公司，浙江 永康 321300)

安吉白茶是绿茶类植物，其茶叶拥有低温敏感的特性，浙江湖州的安吉县是其盛产之地[1]。安吉白茶含有许多有效的保健成分，具有提神消乏、降低血脂和保护牙齿等作用[2]。其中，茶多酚是茶叶中主要的有效成分之一。茶多酚又叫茶单宁或茶鞣质[3]，在茶叶干基中的含量为15%～35%，远高于其他植物。现代医学研究发现，茶多酚具有消除人体自由基与抵抗衰老、预防心血管病、促进血糖血脂减低、抗癌治病、改善肠道吸收、抑菌、抗辐射、沉淀重金属等一些特殊有效的药理作用[4-11]。安吉白茶在清明后有大量的“粗老茶”，茶叶口感风味较差，直接饮用价值较低，容易滞销。优化安吉白茶水溶性多酚提取工艺，可对低值老茶叶加以利用，扩大安吉白茶的经济效益。目前，国内对安吉白茶中茶多酚提取的研究报道较少。茶多酚普遍分布在细胞内，使用水浴超声提取的方法不但环保且具有较高的安全性，且可有效地破碎细胞并加速茶多酚的向外渗透[12]，缩短提取时间。而响应面法不局限于孤立的试验点，可在试验范围连续进行分析得出最优方案。因此选择超声波提取方法，响应面法优化安吉白茶水溶性茶多酚提取的最佳条件，以期为安吉白茶水溶性多酚的工业化开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

安吉白茶，购于安吉县茶叶市场。

仪器：UV-2550紫外可见分光光度计，日本岛津UV-2550；BT-224S电子天平，德国赛多利斯；KQ2200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；5810R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

试剂：没食子酸、福林酚试剂和碳酸钠试剂均为分析纯；试验用水均为去离子水。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制 使用高精度电子天平准确称量5 mg的标准没食子酸样品，并用去离子水在50 mL容量瓶中准确定容，配制成0.1 mg/mL没食子酸标准液。分别移取0 mL、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL和1.50 mL标准液，然后分别吸取0.5 mL的福林酚试剂和2 mL质量分数为12%的碳酸钠试剂依次加入后，去离子水定容至25 mL，摇晃均匀，平行3组。在常温下做遮光处理，进行避光反应0.5 h，避光反应结束后，使用紫外分光光度计，在765 nm波长处测各组样品的吸光度。以配制的没食子酸标准液浓度C(μg/mL)为横坐标，测得的吸光度A为纵坐标绘制标准曲线图，并得到回归方程式[13-14]：

A=0.104 2C+ 0.014 8 (R2=0.992 1)

1.2.2 安吉白茶中茶多酚的提取及含量测定 取50 g 安吉白茶，置于研钵中研碎，将粉末保存于锥形瓶中，密封待用。

称取安吉白茶粉末0.5 g，装入50 mL试管中，以100℃去离子水为溶剂，水浴超声下提取一段时间，过滤定容后分别吸取2 mL的样品溶液至4支试管里，分别将等量的0.5 mL福林酚试剂与2 mL质量分数为12%的碳酸钠试剂依次移加，定容并做遮光处理及吸光度的测定，根据之前的没食子酸标准曲线，将得到的数据代入回归方程计算安吉白茶粉末中茶多酚含量[13-14]。

1.2.3 单因素试验 在较高温度下茶多酚提取量较高，为便于控制温度，在100℃左右进行试验，对水浴超声的提取时间、提取茶多酚次数及安吉白茶与去离子水的料液比进行分析，通过单因素试验考察各因素提取茶多酚的最佳条件[13]。

1) 料液比。在超声处理0.5 h，安吉白茶与去离子水的料液比(g∶mL，下同)分别为1∶20、1∶40、1∶60和1∶80条件下各提取1次，测定茶多酚含量，下同。

2) 提取时间。在料液比1∶20，超声处理时间分别为0.5 h、1 h、1.5 h和2 h条件下各提取1次。

3) 提取次数。在料液比为1∶20，超声提取时间0.5 h条件下分别提取1次、2次、3次和4次。

1.2.4 响应面试验设计[15-17]基于单因素试验结果，取安吉白茶与水的料液比、水浴超声提取的时间以及提取次数3个因素作为自变量，安吉白茶多酚提取量为响应值，进行3因素3水平响应面试验设计。通过Design Expert 8.0.6对试验数据进行回归解析，得到安吉白茶多酚提取的最优工艺参数。其因素水平见表1。

表1 超声波提取安吉白茶茶多酚的响应面试验因素及水平

1.2.5 最佳工艺的验证 在响应面试验的最佳工艺条件下进行安吉白茶茶多酚的提取，并进行测定。

2 结果与分析

2.1 不同因素对安吉白茶茶多酚提取量的影响

从图1看出不同料液比、提取时间及提取次数的安吉白茶茶多酚含量变化。

2.1.1 料液比 随着料液比的增加，提取到的安吉白茶茶多酚含量先急剧增多，后增加速率变慢，当料液比超过1∶60后，提取到的茶多酚含量减少。因为料液比增加将有助于安吉白茶的茶多酚和浸提液之间的分子接触及向外溢出，从而利于多酚的提取。但试验使用的是超声波辅助提取法，其原理是通过共振使细胞破裂。当液料比增大到1∶60之后，整个溶液体系的体积过于庞大，使超声波的共振效果下降，从而导致提取效果下降。因此，料液比宜在1∶60左右。

2.1.2 提取时间 随着提取时间的不断延长，安吉白茶水溶性多酚的含量呈先增后降趋势，1 h时，安吉白茶水溶性多酚的含量增加非常迅速，且其含量达较大值，为141.6 mg/g。这是因为提取时间太短，安吉白茶中的茶多酚无法被完全的有效提取出来，而当超声提取时间太长时，茶多酚可能会被缓慢氧化，导致最后含量下降。因此超声提取的适宜时间应为1 h。

2.1.3 提取次数 随着提取次数增多，安吉白茶水溶性多酚的含量也不断增加，从1次到3次的提取过程中，茶多酚含量的增长趋势明显，在3次提取后，茶多酚含量增长趋势有所下降。考虑到提取次数增多，时间与成本都会增加，故提取次数选择3次为宜。

2.2 安吉白茶茶多酚的最佳提取工艺

2.2.1 二次回归模型的建立 对表2中不同处理的安吉白茶茶多酚提取量进行回归解析得到回归模型：Y=181.46+6.11A+3.08B+4.39C+0.97AB-0.2AC-0.78BC-3.08A2-5.96B2-1.88C2。

表2 超声提取安吉白茶的茶多酚提取量

经方差分析，该回归模型的P<0.000 2，失拟项P=0.622 4，回归模型极显著(P<0.001)，失拟项不显著(P>0.05)，表明二次线性回归方程显著，重复试验的数据拟合良好，可以对响应值进行很好的预测。其中因素A、B、C和B2对水溶性茶多酚提取率为显著影响(P<0.01)。各种因素对提取水溶性多酚的影响从小到大依次为料液比、提取次数和提取时间。

2.2.2 响应面分析 从图2可知，提取次数固定条件下，伴随超声波辅助提取时间的延长，水溶性茶多酚含量呈先增后减趋势。而料液比若不断增大，水溶性茶多酚的含量也呈增长趋势且增大的速率逐步变缓。料液比对水溶性茶多酚含量的影响小于提取时间，与方差分析一致。此外，等高线图的最中心总体为椭圆形，提取时间和提取料液比间相互作用显著，且最高点落于试验区间，说明料液比和提取时间的最适条件在探究范围内，可根据最高点对应的数值得出最适条件。

从图3可知，响应面表现为一个斜面，提取时间固定时，无论是增加提取次数还是增大安吉白茶与去离子水的比例，水溶性茶多酚含量均呈逐渐增加并趋于平稳的趋势。分析等高线图发现，无法找到高点，最高点偏离试验区间，且等高线表现为接近正圆，表示提取次数与提取料液比间的相互作用不显著。

从图4可知，若提取时间延长，水溶性茶多酚含量呈先增后减的变化。若提取次数增多，水溶性茶多酚含量呈先增后平稳变化。从响应面的坡度分析可知，提取时间对水溶性茶多酚含量的影响较提取次数更显著，提取次数和时间的相互作用也相对显著。

2.2.3 最佳工艺及验证 采用Box.Behnken响应面优化法预测最优工艺为安吉白茶与去离子水的料液比为1∶49.12(g∶mL)，提取时间为1.10 h，提取次数为3.99次，预测茶多酚提取量为187.1 mg/g。按得出的理论最优工艺略作调整进行试验，重复验证，在安吉白茶与去离子水的料液比为1∶50(g∶mL)，提取时间为1.10 h，提取次数为4次时，得到茶多酚提取量为188.5 mg/g，实测值与预测值的差异为1.4 mg/g。与理论预测值基本符合，均在187 mg/g左右，表明模型拟合程度良好。考虑到大规模工业生产时无法达到实验室的精度要求，及大规模生产的效率问题，综合RSM和提取成本，建议最优提取工艺条件为料液比1∶50(g∶mL)、提取时间66 min、提取次数为3次，此时水溶性茶多酚提取含量为182.6 mg/g。

3 结论与讨论

试验结果表明，安吉白茶茶多酚提取的最佳工艺是料液比1∶50(g∶mL)、提取时间66 min、提取4次。考虑到大规模工业生产时无法达到实验室的精度要求，及大规模生产的效率问题，综合RSM和提取成本，建议最优提取工艺条件为料液比1∶50(g∶mL)、提取时间66 min、提取3次，此时水溶性茶多酚提取含量为182.6 mg/g。

茶叶可溶性多酚用途十分广泛，在临床医药[18]，保健品药学[19]、美容化妆[20-21]和蔬果保鲜[22]等中均可应用。采用辅助超声波破碎提取技术，较传统的茶多酚提取方法在操作方法上更简便，提取含量更多，性价比更高。