魏海涛 方秋华 张炳顺 刘初亮 刘铄佳

摘 要 肝素被用于医学上对静脉血栓的治疗，是常用的天然抗凝物质，但其易产生出血等副作用。低分子肝素可以很好地弥补肝素的不可控性，但我国目前对低分子肝素的研究尚未成熟，因此本次研究主要对各种不同的制备工艺技术进行归纳总结，并通过分子量检测和抗凝血活性检测作为判定依据，为低分子肝素的生产提供一定的理论依据。

关键词 肝素;低分子量;工艺技术

肝素是一种天然糖胺聚糖类物质，广泛分布在哺乳动物脏器内，常与蛋白质结合成复合物，在医学上当作抗凝药物使用。但低分子肝素受降解工艺的影响，降解后的化学结构也会不同，进而影响其药代动力学特征[1]。为了提供制备低分子肝素的理论依据，本次研究主要对所制备的产物结构功能进行简述，以及其几种制备工艺技术的总结归纳和对比，并选取最优制备方法进行结果检测，现将试验内容总结如下。

1 肝素及低分子肝素的结构与功能

1.1 肝素的结构与功能

肝素由两种交替连接的糖醛酸和一种葡萄糖胺组成，这两种糖醛酸以L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸的形式存在，另一种葡萄糖胺以α-D-葡萄糖胺的形式存在。在它们或其衍生物上可进行硫酸化、乙酰化等的修饰，使肝素变得复杂可变。天然存在的肝素总分子量多在4～30KDa之间，大部分集中于12～15KDa间[2] 。

人体的血液之所以能够自由流动，依赖的是体内的凝血与抗凝血系统。肝素可以加强或激活抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）的作用，从而延长凝血时间。这里主要阐述肝素的抗凝血反应机制。

1.2 低分子肝素的结构与功能

低分子肝素由肝素经过物理、化学、生物酶等方法降解得到，因此其结构序列与肝素相似，但分子量会变小，一般为3～8KDa。除了具有肝素的功能以外，低分子肝素也用于普通抗凝剂所不适用的治疗中，如弥散性血管内凝血以及改善中风引起的血液高凝状态等。

2 低分子肝素的制备

2.1 物理法制备低分子肝素

物理方法包括超滤法、凝胶过滤法、乙醇沉淀法、色谱法、超声波等，操作简单、高效可控，主要用于结构的测定和生物活性的研究。物理法对低分子肝素结构的破坏很少，但是普通肝素中含的低分子片段较少，取得率很低，所以物理法制备低分子肝素一般不用于工业化生产。

2.2 生物酶解法制备低分子肝素

生物酶解法使利用肝素酶的水解，将硫酸葡萄糖胺和硫酸艾杜糖醛酸之间的1，4-糖苷键断裂形成末端残基，该末端残基在234nm处吸收值很高。目前为止生物酶解法的技术已相对成熟，反应对环境无污染，但肝素酶的成本也比较高，一般不适宜应用于工业化生产。

2.3 化学裂解法制备低分子肝素

化学裂解法所用的方法有多种，例如过氧化氢法、β-消除降解法和亚硝酸降解法等，它们的原理都是使肝素的糖苷键发生断裂从而得到低分子肝素。其中亚硝酸法制备低分子肝素在工业化生产中更具优势，也是目前国际市场大多采取的方法。

（1）过氧化氢法

氧化物通过氧化作用使肝素中的糖苷键断裂，制备出低分子肝素。同样在一定温度、酸碱度的条件下，可以制备出低分子肝素，但在生产过程中造成污染。

（2） β-消除降解法

β-消除降解法的优点是通过控制其反应条件，可以获得较为均一的低分子肝素;参加反应的试剂在最终产品中不存在。但缺点是工艺烦琐，对技术要求高，成本高，稳定性能也稍逊一筹。

（3） 亚硝酸降解法

亚硝酸降解法是将肝素在酸性条件下加入解聚剂，经过一段反应时间使糖苷键断裂，再将pH值调至中性终止反应。该法是目前制备低分子肝素使用的最广泛的工艺技术，通过控制不同反应条件，可有效降低肝素分子量。

3 低分子肝素的分析检测

目前对低分子肝素的检测手段有很多，主要使用高效液相色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、核磁共振法、质谱法等手段。本实验应用质谱仪进行检测，它采用使试样中各组分发生电离的基本原理，最后通过荷质比进行计算获得结果。因亚硝酸降解法在工业化生产上最为常见，此处以亚硝酸降解法为例。

4 低分子肝素生物活性的测定

低分子肝素的抗凝血因子FXa与抗凝血因子FⅡa的活性效价受其分子量的影响，除此之外组成低分子肝素的单糖排列方式以及取代基的不同均可導致不同的生物活性。对于低分子肝素生物活性的最终判定以效价为指标。详细可见表1。

通过上表1的数据可知，低分子肝素与肝素的抗FXa生物活性相比变化幅度很小，这说明经亚硝酸降解法制备的低分子肝素能够很好的保留其抗凝血活性;而低分子肝素的抗FⅡa的活性却下降了许多，这说明低分子肝素的安全性较肝素高，副作用有所减小。可信限率FL%是精密度的标志，与肝素相比低分子肝素的可信限率更低，及可信度更高。数据显示该法基本达到了制备低分子肝素的目的。

5 结束语

通过对几种不同低分子肝素工艺技术的归纳，得知采用亚硝酸降解法制备低分子肝素最具可行性，且通过检测结果可知其制备的低分子肝素能够很好地达到制备目标。因此今后在研究低分子肝素来源上和更高效的制备低分子肝素的工艺上，仍有许多值得我们探讨的地方。

参考文献

[1] 刘欣悦.质谱联用新技术在低分子肝素药物质量控制方面的应用[D].济南：山东大学，2018.

[2] 黄满红.肝素的提取精制和亚硝酸法制备低分子肝素的研究[D].西安：陕西科技大学，2016.