才美慧 张 超 马 越，4 赵晓燕，5 李 斌

（1 沈阳农业大学 辽宁沈阳110866 2 北京市农林科学院蔬菜研究中心 北京100097 3 果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室 北京100097 4 农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室 北京100097 5 农业部蔬菜产后处理重点实验室 北京100097）

番茄红素分子式为C40H56，属于高度不饱和结构，在天然状态下，番茄红素分子以全反式构型为主，存在数十种异构体，一般全反式番茄红素占总量的80%～97%[1-2]。研究显示：顺式番茄红素比全反式番茄红素具有更高的生物利用率和生物活性，可以优先被胃肠道吸收，并显示出更高的抗氧化活性[3-5]。

番茄酱是番茄的主要加工制品，其顺式番茄红素含量主要与番茄品种和生产工艺参数相关。研究显示加热处理是引起番茄红素降解和异构化的重要因素。Lee 等[6]发现番茄红素在50 ℃和100℃加热初期表现出异构化，随着加热时间的延长而发生降解；Shi 等[7]研究表明番茄泥在较低温度下加热利于异构化，其中60 ℃、3 h 条件下总顺式番茄红素增加了18.8%。然而，对于番茄酱浓缩过程中番茄红素分子构象变化的系统研究还鲜有报道。

本研究以顺式番茄红素含量较高的千禧番茄为原料，采用光谱和色谱结合的方法鉴定番茄中番茄红素分子构象，模拟浓缩生产过程，研究浓缩温度和浓缩时间对番茄酱中番茄红素分子构象的影响，阐明浓缩加热过程对番茄红素构象的影响规律，为番茄酱产业提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

市售海南千禧番茄。试剂：正己烷、甲醇、甲基叔丁基醚为色谱纯级；乙醇，丙酮为分析纯级。

1.2 仪器与设备

PL3002 电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；榨汁机HR 2377/E，Philips；旋转蒸发仪R-25，瑞士Buchi 公司；离心机，北京博宇宝感实验设备公司；Agilent1200 系列高效液相色谱仪（配有四元泵及自动进样器、DAD 检测器）、Agilent1290-6530 质谱仪，美国安捷伦公司。

1.3 标准工作曲线的建立

精确（0.0001 g）称取全反式番茄红素标品1 mg，溶解于甲醇∶氯仿=1∶1（体积比）中，配制成1 mg/mL 的溶液，精确量取一定体积，稀释成质量浓度分别为0.00，0.02，0.05，0.10，0.15，0.20 mg/mL的标准溶液，高效液相色谱分析。通过质量浓度-峰面积线性回归，得到回归曲线和方程，计算R2值。通过比较其在相同条件下分析的全反式番茄红素标准物的保留时间和峰面积，在番茄红素提取物中进行鉴定和定量。

1.4 番茄酱的浓缩生产过程

选择无黑斑、无青果、无损的番茄在10 ℃贮藏24 h，用蒸馏水洗涤，离心机脱水，使用转速为18 000 r/min 的榨汁机冷破碎打浆3 min，单层纱布过滤出皮籽后，使用旋转蒸发仪浓缩。使用不同的浓缩时间和温度进行番茄酱浓缩：（1）将浓缩温度设定在60 ℃，浓缩时间分别为2，3，4，5 h，将番茄汁浓缩成酱；具体操作：在浓缩的第1 小时内，浓缩压力为150 mbar，2，3，4，5 h 处理组在剩余时间的压力分别设定为70，100，120，140 mbar；（2）将浓缩时间设定在3 h，浓缩温度分别为40，50，60，70 ℃，将番茄汁浓缩成酱；具体操作：在浓缩的第1 小时内，浓缩压力设定为150 mbar，50，60，70℃处理组在剩余时间的压力分别设定为20，50，100，170 mbar。上述番茄酱均浓缩至可溶性固形物30°左右，然后稀释至29.5°，放置于4 ℃冷藏备用。

1.5 番茄红素的提取

采用有机溶剂浸提法提取样品中的番茄红素。将1 g 样品每次加入10 mL 正己烷-丙酮-乙醇（体积比为50∶25∶25）提取3 次至无色，混合提取液在5 ℃和9 500 r/min 条件下离心15 min。将上清液放入分液漏斗，添加5 mL 超纯水，振荡后分层，除去水相，重复上述萃取操作得到样品。

1.6 番茄红素的分离及其构象鉴定

选择YMC Carotenoid C30 色谱柱（250 mm×4.6 mm I.D.，5 μm），流动相：甲醇（A）、甲基叔丁基醚（B），梯度洗脱条件0 min 55%B，0～6 min B增加至85%，6～16 min B 保持85%不变，16～18 min B 降至55%，流速：0.5 mL/min，分析时间21 min；柱温：30 ℃，检测波长：470 nm，DAD 光谱收集范围：200～800 nm。质谱离子源为APCI（+），质量范围：50～800 m/z；干燥器温度：300 ℃；干燥流量：8 L/min；雾化器压力45 psi；采集频率：2 Hz。

从HPLC 图中提取各组分峰值最高点的全波长扫描图，鉴别番茄红素异构体并截取270～600 nm 的特征区域。然后根据其光谱信息计算Q 值，即在361～362 nm 波长处出现的顺式特征吸收峰与最大吸收波长的主吸收峰强度的比值，再结合特征吸收峰位置及单峰保留时间具体鉴别番茄红素异构体。

1.7 数据统计分析

图像采用美国Origin Lab Corporation 公司Origin 8.0 软件绘制，所有试验均重复3 次，数据结果采用DPS 软件进行方差分析（P＜0.05），试验数据以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

将6 个质量浓度的标准品各取10 μL 进样，图1a 是全反式番茄红素标准品质量浓度为0.20 mg/mL 条件下的HPLC 图，保留时间15.37 min。在每个色谱图上，得到峰面积，做质量浓度-峰面积线性回归，得到线性回归曲线图1b 和回归方程：y=24946.91x （R2=0.9987），线性区间为20～200.0 μg/mL。

2.2 番茄红素构象鉴定

采用HPLC 对千禧番茄中番茄红素异构体进行分离，结合质谱信息和紫外光谱信息对样品中番茄红素分子构象进行分析。图2中HPLC 在470 nm 的光谱图显示共有8 个主要吸收峰，与提取离子流图（m/z 537.4443）的8 个主要响应峰吻合，因此，HPLC 在470 nm 光谱图上的8 个主要吸收峰中均有m/z 537.4443 的离子。图3显示峰7 的二级质谱图，该图与其它7 个峰的二级质谱图基本相似，可以发现m/z 537.4443 的离子碎片离子主要包括m/z 455.3651 和m/z 413.3180，其中，m/z 455.3651 是从番茄红素分子C40H56中裂解脱去-C6H12形成的，m/z 413.3180 是从番茄红素分子C40H56中裂解脱去-C9H18而形成，与陈冬东等[8]的报道一致。因此，HPLC 在470 nm 光谱图的8 个主要吸收峰应为番茄红素分子。

图1 全反式番茄红素标准品的HPLC（470 nm）（a）和质量浓度与峰面积的线性回归（b）Fig.1 HPLC chromatogram （470 nm） （a） and linear regression of mass concentration and peak area （b）for all-trans lycopene standards

图2 千禧番茄的HPLC（470 nm）（a）和提取离子流图（b）Fig.2 HPLC chromatogram （470 nm） （a） and extracted ion chromatogram （b） of Qianxi tomato

图3 番茄红素m/z 537.4443 的二级质谱图Fig.3 MS2 of m/z 537.4443

进一步采用吸收峰的紫外吸收光谱“山字峰”的特征[9-10]及Q 值[7]对其分子构象进行鉴别（图4）。峰1 的保留时间为8.68 min，紫外光谱的光谱特征吸收峰为345，412，436，464 nm，Q 值为0.15，初步鉴别为X1-顺式番茄红素；峰2 的保留时间是9.60 min，吸收峰分别为363，427，452，478 nm，Q 值为0.07，初步鉴别为X2-顺式番茄红素；峰3 的保留时间为9.98 min，吸收峰分别为360，431，457，487 nm，Q 值为0.06，初步鉴别出9，13-二顺式番茄红素；峰4 的保留时间为11.79 min，吸收峰分别为360，444，469，500 nm，Q 值为0.75，初步鉴别出15-顺式番茄红素；峰5 的保留时间分别为12.15 min，吸收峰分别为361，439，465，495 nm，Q 值为0.55，初步鉴别出13-顺式番茄红素；峰6 的保留时间分别为13.81 min，吸收峰分别为366，446，

471，501 nm，Q 值为0.11，初步鉴别出9-顺式番茄

红素；峰7 的保留时间为15.37 min，对应的吸收峰分别为363，446，471，502 nm，在361～362 nm左右处出现的顺式特征吸收峰与最大吸收波长的主吸收峰强度的比值即Q 值为0.07，通过与全反式番茄红素标准品比对一致，鉴别出全反式番茄红素；峰8 的光谱信息与全反式番茄红素一致，依据其含量和出峰顺序可以初步鉴别出5-顺式番茄红素。

图4 峰1～8 的紫外光谱Fig.4 UV spectrum of peak 1-8

2.3 浓缩过程对总番茄红素含量的影响

图5研究浓缩时间对总番茄红素含量的影响，千禧中总番茄红素含量为0.533 mg/g，不同浓缩时间使得总番茄红素的降解程度不同，适当加热可以增强番茄基质中番茄红素的提取能力[7]，浓缩时间4 h 总番茄红素含量相对最高为0.449 mg/g，然而与2 h 和3 h 相比没有显著性差异；随浓缩时间的延长，5 h 时总番茄红素降解显著，与对照相比下降了36.0%。Takeoka 等[11]的研究表明将番茄汁加工至可溶性固形物达到25～30°，期间损失的番茄红素含量最高值为28%，加工时间影响番茄红素的含量。图6显示了浓缩温度对其影响，随着浓缩温度升高，总番茄红素呈逐渐降低的趋势，40，50，60，70 ℃与对照相 比分别 降低了7.7%，21.8%，22.3%，32.6%。张贞理等[12]的研究同样得出随着温度的升高，萃取物中番茄红素的稳定性急剧下降的结果，与文中结论一致。

图5 浓缩时间对总番茄红素含量的影响Fig.5 Effect of concentration time on the content of lycopene

图6 浓缩温度对总番茄红素含量的影响Fig.6 Effect of concentration temperature on the content of lycopene

2.4 浓缩时间对番茄红素构象的影响

表1显示浓缩时间对番茄酱中峰1～8 含量的影响，发现15-顺式番茄红素（峰4）在浓缩2 h 后可以检出，约占总番茄红素的0.54%，当浓缩时间为5 h 时占比增加至0.87%，比2 h 增加了0.61倍。经2，3，4，5 h 浓缩后，13-顺式番茄红素（峰5）含量显著增加，比对照分别增加了0.72，1.14，1.25，1.58 倍，与2 h 相比增长了0.51 倍。9-顺式番茄红素（峰6）浓缩后含量略微增加，可能是因为其在所有顺式异构体中非常稳定[13]。9，13-二顺式番茄红素（峰3）在浓缩时间为2 h 后可检出1.29%，随着浓缩时间的延长，峰3 呈现逐渐增大的趋势；当浓缩时间为5 h 时，占比增加至1.41%，与2 h 相比增加了0.09 倍。根据番茄红素异构体在浓缩过程中的变化，初步判断出稳定性：峰4＜峰5＜峰3＜峰6，与Ferruzzi 等[14]的单顺式番茄红素异构体研究结果一致。研究表明，番茄红素顺式异构体不仅由全反式番茄红素异构而来，它们之间也会存在转化[9]，二顺式番茄红素部分含量的增加有可能是由单顺式番茄红素转化而来[6]。尽管如此，加工浓缩过程中番茄红素的异构化主要是全反式向顺式番茄红素的转化，对照组全反式番茄红素（峰7）含量为85.39%，随着浓缩时间的延长，峰7 分别下降了5.30%，7.77%，7.93%和9.28%，说明番茄酱浓缩时间影响番茄红素异构体的稳定性，浓缩时间越长，异构化越显著。Chasse 等[15]研究表明，平衡状态下全反式番茄红素与5-顺式番茄红素含量较高，而9-顺式番茄红素和13-顺式番茄红素含量相对较少；处理后全反式番茄红素主要转化为13-顺式番茄红素且稳定性差[16]，与本文结论一致。

表1 浓缩时间对番茄酱中峰1～8 含量的影响Table 1 Effect of concentration time on the content of peak 1-8

研究显示，顺式番茄红素异构体之间的铁还原能力测定及ABTS 自由基阳离子清除能力之间没有显著性差异，而清除过氧化氢能力均优于反式异构体，且生物利用度高[17]。研究显示随着浓缩时间的延长，总顺式异构体含量增加，其中，在0～3 h 中，总顺式异构体含量增加53.2%，在3～5 h中，总顺式异构体含量增加6.7%。结合总番茄红素含量，从顺式番茄红素含量提高的角度分析，在60 ℃加热浓缩3 h 或4 h 是比较适宜的工艺参数。

2.5 浓缩温度对番茄红素构象的影响

温度是影响番茄红素异构化和降解的重要因素。由表2可以看出15-顺式番茄红素在浓缩温度为40 ℃后可以检出，约占总番茄红素的0.66%，当浓缩温度为70 ℃时占比增加至0.84%，与40 ℃相比增加了0.27 倍。13-顺式番茄红素在不同浓缩温度下含量增加，与对照相比分别增加了0.99，1.00，1.14，1.22 倍；70 ℃与40 ℃相比增加了0.113倍。5-顺式番茄红素在所选择的温度间差异并不显著，与对照相比略有增加。9，13-二顺式番茄红素在浓缩温度为70 ℃时含量增加至1.40%，比最低温度40 ℃增加了0.10 倍。全反式番茄红素含量随着顺式番茄红素含量的增加而降低，与对照相比分别降低了6.01%，6.64%，7.78%和8.26%。50，60，70 ℃与40 ℃相比分别降低了0.008，0.022 和0.028 倍。表明温度一定程度上影响番茄红素的异构化，高温会加快异构化反应速率。Colle 等[18]将番茄红素油在80，90 ℃加热1 h 发现总顺式番茄红素和全反式番茄红素的异构化不明显；在不考虑加热时间的情况下，番茄红素在低于100 ℃下加热相对稳定[19]；高温可以显著改善体外番茄红素的生物有效率[20]，根据其营养价值给出加工过程浓缩温度参考值为40 ℃和60 ℃，对应的总顺式番茄红素含量分别为0.101 mg/g 和0.093 mg/g。

表2 浓缩温度对番茄酱中峰1～8 含量的影响Table 2 Effect of concentration temperature on the content of peak 1-8

3 结论

采用HPLC 和质谱联用的方式确定番茄红素组分的含量，采用“山字峰”的特征及Q 值确定番茄红素组分的构象，在千禧番茄中共鉴定出8 种番茄红素，分别为X1-顺式番茄红素、X2-顺式番茄红素、9，13-二顺式番茄红素、15-顺式番茄红素、13-顺式番茄红素、9-顺式番茄红素、全反式番茄红素和5-顺式番茄红素。根据番茄红素分子在浓缩过程中的变化率，各组分稳定性强弱为：9-顺式番茄红素>13-顺式番茄红素>9，13-二顺式番茄红素>15-顺式番茄红素。千禧番茄浓缩成番茄酱使得总番茄红素产生不同程度降解，浓缩时间为5 h 时降幅最大为36%，浓缩温度的升高能够造成番茄红素含量的显著降低。浓缩生产过程使得番茄红素异构体向顺式结构转化，营养价值提高，建议浓缩过程参考值为3 h、60 ℃。