杨绍伟 ， 冯 玄 ， 兰新强 ， 熊潇然 ， 祁文凯 ， 谷智聪 ， 赵 芳 ， 李剑美，2 ， 赵 锋，2

(1. 云南省高校民族医药资源研究与东南亚国际合作重点实验室 普洱学院生物活性分子与药物研发重点实验室 普洱学院生物与化学学院 ， 云南 普洱 665000 ； 2. 普洱学院农林学院 ， 云南 普洱 665000)

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 胡蜂蜂蛹野外采集于云南省普洱市澜沧县和墨江县。实验动物为昆明系小鼠，体重27～35 g，购自云南昆明医科大学医学中心。所有动物试验得到普洱学院实验动物伦理委员会的批准。

1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH),购自上海金穗生物科技有限公司)；顺铂(Cisplatin, CDDP), 购自合肥博美生物科技有限责任公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、肌酐(Creatinine, Cr)、血清尿素氮(Urea nitrogen, BUN)测试盒，均购自南京建成生物工程研究所；冰醋酸、石油醚、氯化钠、考马斯亮蓝R-250，均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；其他试验试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 蜂蛹提取物的制备 采集新鲜存活的胡蜂蜂蛹，采用我们开发的蜂蛹提取物制备方法(专利申请号: 201910053227.5)制备蜂蛹提取物后，用Bradford法测定样品蛋白质浓度。

1.2.2 蜂蛹提取物对DPPH自由基的清除作用 DPPH自由基的清除试验参考张小燕等[22]的方法。

1.2.3 对超氧阴离子自由的基清除作用 将1 mL不同浓度的试验样品加入到1.8 mL 50 nmol/L Tris-HCL缓冲液(pH值8.2)中，室温温育10 min后，立即将0.1 mL含有10 mmol/L邻苯三酚的10 mL HCL加入到上述试管中并摇动，于24 ℃下在320 nm检测5 min吸光度值(ΔAs)，用Tris-HCL缓冲液代替测试样品作为空白对照(ΔAb)。超氧自由基清除能力(%)=(ΔAb-ΔAs)/ΔAb×100%。

1.2.4 动物模型制备 动物建模参考高晶晶等[23]的方法，并略有修改。选取18只健康雄性小鼠(动物伦理许可证号：ACUP.531068520171226)，随机分为对照组、顺铂组和蜂蛹组，每组各6只。对照组和顺铂组分别给予0.3 mL 0.9%生理盐水，每天1次，共15 d。蜂蛹组按200 mg/(kg·bw)的剂量灌胃蜂蛹提取物，每天1次，连续15 d。于灌胃的第11天开始，顺铂组和蜂蛹组分别按2 mg/(kg·bw)注射顺铂溶液，每天1次，连续5 d，对照组注射0.9%生理盐水[23]。期间小鼠饲喂基础饲料，监控摄食量，记录每日体重变化。

1.2.5 生化检测及组织标本采集 末次用药24 h 后，断尾取血，并取肾组织及尿液，4 ℃低温保存。分别测定血清、肾组织及尿液中的SOD，GSH-Px，MD，Cr， BUN水平。

1.2.6 肾组织标本H.E.染色 取相同部位肾脏，用2.5%戊二醛溶液固定。脱水、透明后石蜡包埋切片，脱蜡复水；苏木精-伊红(H.E.)染色，光学显微镜下观察肾脏的组织形态学改变。

2 结果

2.1 蜂蛹提取物的抗氧化效果

2.1.1 蜂蛹提取物对DPPH自由基的清除作用 由图1可知，在0～200 mg/mL的浓度范围内，蜂蛹提取物对DPPH自由基的清除率呈剂量依赖性(图1A)。当蜂蛹提取物浓度达到200 mg/mL时，清除率达到57%左右。

2.1.2 蜂蛹提取物对氧自由基的清除作用 由图1可知，蜂蛹蛋白提取物对氧自由基清除效果明显，0～5 mg/mL时蜂蛹蛋白对氧自由基的清除作用随蜂蛹蛋白剂量增加而增加，在蜂蛹蛋白剂量5 mg/mL时达到90%左右(图1B)。抗氧化剂及具有自由基清除活性的物质对顺铂所致的氧化应激有保护作用[12-13]，蜂蛹提取物有良好的自由基清除作用，为进一步研究对顺铂诱导小鼠肾损伤的保护作用提供依据。

图1 蜂蛹提取物的抗氧化效果

2.2 蜂蛹提取物对氧化应激酶系的影响

2.2.1 血清中SOD、GSH-Px、MDA、Cr和BUN的变化 由图2可知，注射过顺铂后，顺铂组与对照组相比，小鼠血清SOD和GSH-Px的活力降低，但没有统计学差异(P>0.05)；蜂蛹组与对照组相比，小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力无明显差异(P>0.05)；蜂蛹组与顺铂组相比，小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力明显升高，约2倍(P<0.05，图2A-B)。说明蜂蛹提取物能够提高顺铂损伤肾脏后的小鼠的血清SOD、GSH-Px活力。

肾小球滤过率(Glomerular filtration rate，GFR)是评价肾脏滤过功能的直接相关指标，而GFR不能直接检测，只能通过某种特定的内源性或外源性滤过标志物如Cr、BUN等而得到。由图2可知，顺铂组与对照组相比，顺铂组小鼠血清中MDA含量升高，但没有统计学差异(P>0.05)；蜂蛹组与对照组相比，小鼠血清中MDA含量无明显变化(P>0.05，图2C)。顺铂组与对照组相比，小鼠血清Cr的含量和BUN含量升高，但没有统计学差异(P>0.05)；蜂蛹组与对照组相比，小鼠血清中Cr和BUN的含量无明显差异(P>0.05，图2E)。蜂蛹组与顺铂组相比，小鼠血清中Cr的含量极明显降低(P<0.01)，BUN含量明显下降(P<0.05，图2D-E)。说明蜂蛹提取物能够降低肾损伤小鼠血清MDA，使血清Cr、BUN水平恢复。

2.2.2 蜂蛹提取物对肾组织SOD和GSH-Px活性的影响 注射顺铂后，顺铂组与对照组相比，小鼠肾组织SOD无显著差异(P>0.05)，灌胃蜂蛹提取物后，肾组织SOD活性高于模型组(P<0.05)，极显著高于对照组(P<0.01，图2F)。模型组肾组织GSH-Px活性较对照物显著差异(P>0.05)，灌胃蜂蛹提取物后，肾组织GSH-Px活力提高，极显著高于对照组与模型组(P<0.01，图2G)。这些结果提示，蜂蛹提取物能够提高或恢复小鼠肾脏的机能。

图2 血清SOD和GSH-Px活性，MDA、Cr和BUN含量的变化结果

2.2.3 蜂蛹提取物对小鼠尿液Cr和Bun的影响 由图3可知，与对照组相比，注射顺铂后，小鼠尿液Cr、Bun上升，但无显著差异(P>0.05)；灌胃蜂蛹后，与模型组相比尿液Cr、Bun无明显下降，但是个体间差异幅度减小，较模型组更稳定(图3A-B)。以上结果提示，蜂蛹提取物能在一定程度上保护损伤肾脏。氧化应激在顺铂肾毒性中有重要作用[24]，蜂蛹提取物提高血清中氧化应激相关酶系的活性，进一步表明蜂蛹提取物对顺铂诱导小鼠肾损伤的保护作用。

图3 蜂蛹提取物对小鼠尿液肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的影响

2.3 小鼠体重变化及蜂蛹提取物对肾组织形态学影响 由图4可知，试验过程中监测了小鼠体重变化，试验前10天各组体重皆随时间增长而增长，蜂蛹组增长量远高于正常组，提示蜂蛹具有极高营养价值；后5天模型组与蜂蛹组均下降，这可能是由于顺铂损伤肾脏引起的体质虚弱(图4A)。顺铂导致小鼠体重减轻，可能是由于其胃肠道毒性导致小鼠摄食量的减少[12]，虽然本试验中灌胃蜂蛹提取物后未能明显改善顺铂引起的小鼠体重下降，但是蜂蛹提取物能在术前改善动物体质，减缓顺铂引起的毒性。与对照组正常小鼠肾脏组织(图4B)相比，顺铂组小鼠肾脏组织细胞松散，出现透明细胞、炎性细胞浸润现象(图4C)；蜂蛹组小鼠肾脏组织相对于顺铂组，透明细胞和炎性细胞浸润现象有所改善，其损伤程度明显减轻(图4D)。提示蜂蛹提取物对顺铂诱导小鼠肾损伤具有保护作用。

3 讨论

中国蜂蛹资源丰富，蜂蛹主要用在保健食品、养生保健酒、保健冲剂等方面[25-26]。早在公元前1 200年前的古籍《尔雅》，以及公元前3世纪的《礼记》中就已经有食用蜂子的记载。在长沙马王堆出土的古医方帛书《五十二病例》就有用蜂胎和蜂子治病的配方[27]。蜂蛹干物质主要组成和所占比例是：蛋白质(46.21%)、脂肪(26.09%)、碳水化合物(20.34%)、总糖(0.73%)、几丁质(4.37%)等。蜂蛹中营养物质丰富，富含黄酮类化合物、维生素类、酶类等多种活性成分，具有良好的抗氧化作用[28-30]。

本试验测定了蜂蛹提取物的体外抗氧化能力及小鼠血清中几种抗氧化物酶的活性和脂质过氧化水平。在一定浓度范围内，蜂蛹提取物清除超氧自由基、DPPH自由基的能力呈剂量依赖性，对超氧阴离子清除效果良好。目前，顺铂毒副作用的防治主要有调整给药方式、水化疗法、使用拮抗剂等方法[5]。本试验中使用天然产物保护顺铂致小鼠肾损伤，顺铂的诱导致使小鼠SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高，但灌胃蜂蛹提取物能增加SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，对肾脏有一定的保护作用。同时，本试验结果表明，顺铂诱导致小鼠Cr和BUN含量升高，灌胃蜂蛹提取物能显著降低Cr和BUN的含量，对肾小球有一定的保护作用。通过观察H.E.染色结果发现，注射顺铂后，小鼠肝脏出现细胞排列疏松，肾脏组织出现透明细胞、炎性细胞浸润的现象，但是蜂蛹提取物灌胃后，肝、肾细胞排列疏松，透明细胞、炎性细胞浸润现象减少，其损伤程度减轻，对小鼠的肝、肾组织的损伤有显著的改善。此外，本试验发现，对照组和顺铂组灌胃和静脉注射0.9%生理盐水，小鼠体重都略有减轻，尤其注射过顺铂的顺铂组和蜂蛹组；但是，试验前10天蜂蛹组灌胃蜂蛹提取物后，小鼠体重明显增加，说明灌胃蜂蛹提取物可以明显改善小鼠体质。综上所述，蜂蛹提取物对顺铂诱导的肾损伤具有一定的保护作用，为药食用资源的开发和产品研制提供更多依据。