吴倩 谭莉娟 张炅璐

[摘要] 目的 基于生物信息学分析平台探讨龟芍平颤方抗帕金森病的分子机制。 方法 从1994年4月～2019年12月的中英文数据库（中国期刊全文数据库、维普期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库、中华本草、PubMed、Web of Science、SciFinder Scholar）中获得龟芍平颤方（龟甲、白芍、川芎、天麻）的化学成分，并于PubChem数据库中查找该方每种有效成分的人源活性靶蛋白。检索Gene数据库，查找帕金森病相关人源基因。将上述靶蛋白与基因上传至生物信息学分析平台，分析两者共同涉及的分子网络与生物学通路。 结果 获得龟芍平颤方人源活性靶蛋白323个（龟甲58个、白芍119个、川芎72个、天麻74个）;获取帕金森病相关人源基因392个。建立上述靶蛋白及基因共同作用的主要分子网络，并甄选出G-蛋白偶联受体信号传导通路等10条主要的生物学通路。 结论 龟芍平颤方可能通过调控G-蛋白偶联受体信号传导通路等发挥抗帕金森病作用。

[关键词] 帕金森病;龟芍平颤方;生物信息学分析平台;G蛋白偶联受体

[中图分类号] R742          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（a）-0011-05

[Abstract] Objective To explore the molecular mechanism of Guishao Pingchan Formula against Parkinson′s disease （PD） based on ingenuity pathway analysis （IPA） platform. Methods The chemical constituents of Guishao Pingchan Formula [Carapax et Plastrum Testudinis （Guijia）， Radix Paeoniae Alba （Baishao）， Rhizoma Ligustici Chuanxiong （Chuanxiong） and Rhizoma Gastrodiae （Tianma）] were searched from China national knowledge infrastructure （CNKI）， viper database （VIP）， China biology medicine disc （CBMdisc）， Chinese materia medica， PubMed， Web of Science， SciFinder Scholar and active target proteins were retrieved from PubChem from April 1994 to December 2019. Meanwhile， PD related genes were retrieved from Gene. Finally， target proteins of Guishao Pingchan Formula and PD related genes were uploaded to IPA platform， and the molecular networks and classical biological pathways involved in them were compared. Results Three hurdred and twenty-three human active target proteins （58 Guijia， 119 Baishao， 72 Chuanxiong， 74 Tianma） and 392 PD related genes were obtained， then a major molecular network in which both were involved were built. Meanwhile， 10 main canonical pathways involved together were selected， such as G-protein coupled receptors signaling. Conclusion Guishao Pingchan Formula might play an anti-PD role by regulating G-protein coupled receptors signaling and other pathways.

[Key words] Parkinson′s disease; Guishao Pingchan Formula; Ingenuity pathway analysis platform; G-protein coupled receptors

帕金森病（PD）又称震颤麻痹，是一种常见的神经系统退行性疾病，多发生于中老年，我国65岁以上的老年人发病率约为1.7%[1]。PD以黑质致密区多巴胺能神经元变性缺失和路易小体形成为病理特征，以肌强直、静止性震颤等运动异常为典型表现[2]。左旋多巴类药物是治疗PD的“金标准”，但长期使用的不良反应较大[3-4]。中药单独或联合左旋多巴类药物治疗PD已取得一定临床效果[5-7]。课题组基于临床实践、循证医学和数据挖掘方法，筛选出了基于基本病机的抗PD中药基础方——龜芍平颤方（GPF）：龟甲、白芍、天麻、川芎，但其作用机制尚不明确。对于中药多成分、多靶点的特性，生物信息学与网络药理学为从分子网络角度研究其作用机制提供了技术和理论上的支持[8-9]。生物信息学分析（IPA）平台就是常用的一种功能强大的分析工具[10-11]。因此，课题组运用IPA平台分析预测GPF抗PD的分子机制，为进一步完善PD治疗方案提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 获取GPF靶蛋白

检索时限：1994年4月～2019年12月。数据库：中国期刊全文数据库（CNKI）、维普期刊全文数据库（VIP）、中国生物医学文献数据库（CBMdisc）、《中华本草》、PubMed、Web of Science、SciFinder Scholar。检索龟甲、白芍、川芎、天麻的化合物，剔除重复者后，输入到PubChem（http：∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中确定对应的人源活性靶蛋白。

1.2 获取PD相关基因

以“Parkinson′s disease”为关键词，在Gene（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）数据库中查找并记录PD所有相关人源基因。

1.3 构建GPF靶蛋白分子网络和PD相关基因分子网络

将已获取的靶蛋白和基因信息上传至IPA平台，利用其网络分析功能，分别构建GPF靶蛋白分子网络和PD相关基因分子网络，并分析两者主要涉及的疾病与生物功能。

1.4 分析GPF靶蛋白与PD相关基因共同作用的生物学通路

将GPF活性靶蛋白与PD相关基因上传至IPA平台，获得主要生物学通路，并予以评分，且都有相应的P值。基准线代表-log（P-value），且P = 0.05。再运用平台的比较模块，选取两者共同作用的通路进一步研究，并予图表形式展示其可能的分子网络机制。

2 结果

2.1 GPF活性靶蛋白的疾病与生物功能及分子网络构建

获得GPF人类活性靶蛋白323个（龟甲58个、白芍119个、川芎72个、天麻74个），录入其相应的GI号，上传至IPA平台后，得到對应的疾病与生物功能，主要集中在细胞凋亡与存活、机体损伤与异常等方面，图1为前10位的疾病类型，表1为前5位的相关分子网及生物功能。GPF靶蛋白相关分子网络共23个，运用IPA构建分子网络（图2）。

2.2 PD相关基因生物功能与分子网络

获得PD人源相关基因392个，对应的分子网及生物功能主要集中在细胞凋亡与存活、神经系统疾病等方面，取排序前5位的进行展示（表2）。PD相关基因的分子网络共27个，运用IPA构建分子网络（图3）。

2.3 GPF靶蛋白与PD相关基因共同作用的主要生物学通路

因每个靶蛋白及相关基因可能作用于不同的通路，而各通路之间又存在交集，故本研究只展示了IPA结果中排序前10的生物学通路，分属于GPF靶蛋白（图4）及PD相关基因（图5）参与。

2.4两者共同作用的生物学通路

以PD相关基因为基准，对比两者共同作用且相关度最高的信号通路，可视化呈现前10条（图6）。以此探寻GPF涉及的相关性最高的生物学通路，如图6纵轴所示，信号通路为PD相关且相关度排序前10的信号通路，深色条柱为与PD的相关度，浅色条柱为共同信号通路中GPF的相关度。因本研究旨在探寻药物的抗PD机制，故预测共同通路中GPF的相关度最高的G-蛋白偶联受体（GPCRs）信号传导可能是GPF抗PD的主要分子机制。

3 讨论

PD属于中医“颤证”范畴，基本病机以肝肾不足、虚风内动为关键，风贯穿始终，久病夹瘀[12-15]。GPF针对PD基本病机，其中龟甲补肝肾，养筋脉，定神志;白芍养阴缓急，平抑肝阳;天麻祛风通络，熄风止痉;川芎既可活血祛风，又能防止其他三药的壅滞。四药合用，既可补益肝肾、填精补髓、濡养筋脉以治本，又可平肝息风、安神定志、活血通络以治标，可收到良好的防治PD之效。

药理学研究也证实了GPF所含药物的抗PD作用。龟甲提取物活性部位可减轻神经损伤症状，在神经细胞缺血损伤后，可使神经干细胞增殖，并向多种细胞系分化[16];有研究表明，龟甲提取物可能通过调控Otx2基因促进神经干细胞向多巴胺神经元分化[17]。芍药苷对纹状体及黑质多巴胺能神经元具有明显保护作用，能够明显改善6-羟基多巴胺诱导的PD大鼠神经损伤[18]。天麻水煎液能显著上调PD小鼠5-羟色胺受体、神经肽Y受体、N-甲基-D-天门冬氨酸离子能谷氨酸受体2A和2B及多巴胺受体D3的表达[19]。有动物实验表明，天麻素可以减慢多巴胺神经元的代谢速度，进而减少多巴胺的自身氧化，使多巴胺含量升高，并能保护多巴胺能神经元[20]。川芎嗪可以减少PD大鼠的氧化应激损伤，改善纹状体细胞外液多巴胺代谢率，稳定脑组织内多巴胺浓度[21];同时川芎对PD小鼠也有神经保护作用[22]。

基于IPA平台的分析，预测GPCRs信号传导通路为GPF抗PD最可能的生物通路。GPCRs是一个超级膜蛋白家族，参与生物体内大部分的信号调节和生理活动，其下游有多种信号通路，以环腺苷酸和磷脂酰肌醇为主要通路。多巴胺受体（DR）属于GPCRs，DR家族共有5个成员，在中枢神经系统以D1R和D2R分布最为广泛。D1R和D2R可以通过G蛋白依赖的方式，通过cAMP/PKA信号通路、磷酯酶C信号通路和G蛋白门控内向整流钾离子通道信号通路介导脑内多巴胺能信号转导，调控运动、认知等神经功能，并参与PD等神经退行性病的发生、发展[23]。GPCRs和PI3K/AKT信号通路通过鸟苷三磷酸酶产生联系，并可保护残存的多巴胺能神经元[24]。近来研究表明，小鼠GPCR6缺乏会显著影响黑质纹状体多巴胺能系统，同时在纹状体多巴胺耗竭后产生激动剂激活DR[25]。GPF可能正是通过GPCRs等生物学通路发挥抗PD效应，但尚需进一步的研究进行验证。

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（收稿日期：2020-02-10  本文编辑：李亚聪）