汪海宣，桑晓斌，许倩

（1.合肥市食品药品检验中心，合肥 230051； 2.安徽省先锋制药有限公司，合肥 230001）

更昔洛韦是继阿昔洛韦之后开发的一种新型核苷酸嘌呤类抗病毒药，由英国Syntex 公司研制并于1988 年上市［1］，是首个用于治疗人体巨细胞病毒感染的有效抗病毒药［2］，其临床应用也越来越广泛，如外用更昔洛韦预防内皮角膜移植术后巨细胞病毒内皮炎［3］，临床使用更昔洛韦的多种治疗方案治疗肠道巨细胞病毒性结肠炎［4］，腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶联合更昔洛韦对肝细胞癌有一定的治疗作用［5］等。药品中杂质含量直接影响药物质量和疗效，因此需要对更昔洛韦杂质进行分析，以更好的控制药物质量，减少或降低药物的不良反应。

参照国外相关药品法典［6-8］对更昔洛韦中可能含有的6 种已知杂质进行研究，分别为2-氨基-9-［［（2-氯丙基-2-烯-1-基）氧］甲基］-1，9-二氢-6H-嘌呤-6-酮（杂质A）、（2RS）-2［（2-氨基-6-氧代-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基）甲氧基］-3-羟丙基丙酸酯（简称杂质B）、2-氨基-9-［［（1Rs）-2-氯-1-（羟甲基）乙氧基］甲基］-1，9-二氢-6H-嘌呤-6-酮（简称杂质C）、2-氨基-9-［［［2-羟基-1-（羟甲基）乙氧基］甲氧基］甲基］-1，9-二氢-6H-嘌呤-6-酮（简称杂质D）、2-氨基-9-［［（2Rs）-2-3-二羟基丙氧基］甲基］-1，9-二氢-6H-嘌呤-6-酮（简称杂质E）和2-氨基-1，9-二氢-6H-嘌呤-6-酮（简称杂质F）。杂质可能由更昔洛韦原料合成工艺引入［9-12］，杂质A、杂质C 和杂质E 为起始物料侧链，杂质B 和杂质F 为合成副产物。

目前国内相关标准采用高效液相色谱法检测更昔洛韦含量及有关物质，用主成分自身对照法计算其总杂质的相对含量［13］，无法反映出其特定杂质的具体含量。笔者参照国外相关药典［6-8］和文献资料［14-17］，建立高效液相色谱法对注射用更昔洛韦和原料中可能含有的6 种已知特定杂质进行研究，分别测定各特定杂质的含量。由于杂质D 结构不稳定等因素，单体较难获得，国内外均无法单独提供该单体对照品，采购欧盟对照品系杂质A，B，C，D，E，F 混合物，无准确杂质D 含量及浓度，笔者采用该混合物对照品对杂质D 进行定位及确认相对保留时间，采用面积归一化法对其含量进行考察。该方法简单快捷，专属性强，精密度好，可用于更昔洛韦中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E 和杂质F 的检查分析，为更好地控制更昔洛韦原料及制剂的质量提供了参考依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

电子天平：XP-205 型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；

高效液相色谱仪：LC-20A 型，配备SPD-20A二极管阵列检测器（DAD），日本岛津公司；

多功能参数测量仪：Sevenmullti 型，瑞士梅特勒-托利多公司；

恒温恒湿培养箱：BSC-150 型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

更昔洛韦原料：药用，批号为2017-1S，2017-2 s，上药康丽（常州）药业有限公司；

注射用更昔洛韦：批号为2017-1t，2017-2t，2017-3t，自制；

更昔洛韦对照品：批号为100380-201103，中国食品药品检定研究院；

更昔洛韦杂质A，B，C，E 对照品：批号分别为1840-086A1，1563-053A8，2466-039A1，1863-093A2，加拿大梯尔希公司；

更昔洛韦杂质F 对照品：批号为R018Q0，美国药典委员会；

更昔洛韦杂质混合物对照品：包含杂质A，B，C，D，E 和F，批号为002472，欧洲药品质量和保健理事会；

乙腈、三氟乙酸：色谱纯，美国赛默飞公司；

氢氧化钠、盐酸、过氧化氢：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：USP L9 SCX 柱（250 mm×4.6 mm，10 μm，英国沃特曼公司），以强酸性阳离子交换基团键合硅胶为填充剂；流量：1.5 mL／min；流动相：0.05%三氟乙酸溶液-乙腈（50∶50）；检测波长：254 nm；柱温：40℃；进样体积：20 μL。

1.3 溶液的配制

供试品溶液：精密称取更昔洛韦原料和注射用更昔洛韦内容物适量，分别用流动相溶解并制成约含0.6 mg／mL 更昔洛韦的溶液。

更昔洛韦对照品溶液：精密称取更昔洛韦对照品适量，用流动相溶解并制成约含0.6 mg／mL 更昔洛韦的溶液。

对照溶液：精密量取1 mL 供试品溶液，置于100 mL 容量瓶中，用流动相稀释至标线，摇匀，再精密量取5 mL，用流动相稀释定容至50 mL，摇匀。

阴性样品溶液：取制剂的除主成分外辅料配制相同浓度溶液。

更昔洛韦系列标准工作溶液：精密移取更昔洛韦对照品溶液1 mL 至100 mL 容量瓶中，加流动相稀释并定容至标线，摇匀，再分别精密吸取0.5，1，1，3，2，2 mL，依次置入20，20，10，20，10，5 mL 容量瓶中，加流动相稀释并定容至标线，摇匀，研制成更昔洛韦的质量浓度分别为15，30，60，90，120，240 μg／mL 的更昔洛韦系列标准工作溶液。

杂质储备溶液：精密称取杂质A、杂质B、杂质C、杂质E 和杂质F 对照品适量，分别置于5 个棕色量瓶中，杂质F 中加入0.2 mol／L 的NaOH 溶液3 mL，分别用流动相溶解并稀释定容至标线，摇匀，制成杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F 质量浓度分别约为90，120，90，90，240 μg／mL 的杂质储备溶液。

系统适用性溶液：取一支更昔洛韦杂质混合物对照品（含杂质A，B，C，D，E 和F），用1 mL 上述更昔洛韦对照品溶液溶解。

杂质定位溶液：分别精密移取杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F 对照储备溶液各1 mL，置于5 只100 mL 容量瓶中，依次用流动相定容至标线，摇匀，制成杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F 的质量浓度均分别为为0.9，1.2，0.9，0.9，2.4 μg／mL的杂质定值溶液。

杂质混合储备溶液：分别精密移取杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F 杂质储备溶液各5 mL，置于同一50 mL 棕色量瓶中，加流动相稀释并定容至标线，摇匀，制成杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F 的质量浓度分别约为9，12，9，9，24 μg／mL 的杂质混合储备溶液。

系列混合杂质标准工作溶液：分别精密吸取杂质混合储备溶液0.5，1，1，3，2，2 mL，依次置于20，20，10，20，10，5 mL 容量瓶中，加流动相稀释并定容至标线，摇匀。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

参照国内外相关药品法典［6-8］和相关文献资 料［9］，对供试品溶液和系统适用性溶液经二极管阵列检测器在200～400 nm 范围内进行全扫描，更昔洛韦和各杂质的最大吸收波长均在（254±2） nm内，故选择254 nm 为检测波长，经试验研究表明，各杂质峰的峰纯度均大于0.999。

2.2 色谱条件的选择

参照国内外相关药品法典［6-9］以及文献资 料［2，10-14］，对不同填料的色谱柱包括十八烷基键合硅胶柱，氰基键合硅胶柱，氢型阳离子交换键合硅胶柱，磺酸基阳离子交换键合硅胶柱；流动相包括0.05%三氟乙酸-乙腈（50∶50），0.25%磷酸二氢钾溶液-甲醇（9∶1）；柱温包括30，35，40℃分别进行考察实验，最终选择磺酸基阳离子交换键合硅胶柱，0.05%三氟乙酸-乙腈（50∶50）为流动相，柱温为40℃，各杂质峰和更昔洛韦峰分离良好。

2.3 专属性试验

2.3.1 空白干扰试验

分别精密吸取1.3 中阴性样品溶液、供试品溶液、混合杂质标准工作溶液（杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F 浓度分别约为0.9，1.2，0.9，0.9，2.4 μg／mL）各20 μL，按1.2 色谱条件进行测定，得到供试品溶液和对照品溶液色谱图见图1 和图2。由图可知，阴性样品溶液在该位置及附近未出现峰，因此辅料不干扰主峰测定。

图2 混合杂质标准工作溶液色谱图

2.3.2 已知杂质的定位及分离度试验

分别取1.3 中系统适用性溶液和杂质定位溶液，按1.2 色谱条件进行测定，依次对各杂质定位，系统适用性溶液色谱图见图3。样品与杂质的定位与分离，结果列于表1，由表1 可以看出，主峰与相邻杂质及各杂质之间分离度均大于1.5，各成分分离度良好，专属性较强，表明方法适用可行。

2.3.3 强制降解试验

精密称取更昔洛韦原料约12 mg，分别置于5只容量瓶中，依次进行酸、碱、氧化、高温、光照破坏，方法及结果列于表2。按1.2 色谱条件考察更昔洛韦降解情况，各物质含量列于表3(≥0.02%)。考察主峰与已知杂质分离度及主峰的峰纯度，结果列于表4。由表4 可知，各条件下主峰的峰纯度均大于99.5%，主峰纯度良好。

图3 系统适用性溶液色谱图

2.3.4 强制降解试验

精密称取更昔洛韦原料约12 mg，分置于5 只20 mL 容量瓶中，依次进行酸、碱、氧化、高温、光照破坏，破坏方法及试验结果列于表2。由表2 可知，降解方式并不影响主色谱峰的分离效果。按1.2 色谱条件测定各破坏条件下供试品溶液中更昔洛韦和杂质含量，各物质含量列于表3（≥0.02%）。考察主峰与已知杂质分离度及主峰的峰纯度，结果列于表4。由表4 可知，各条件下主峰的峰纯度均大于99.5%，主峰纯度良好。

表1 样品与已知杂质的定位和分离试验

表2 破坏实验方法及结果

表3 各破坏条件下供试品溶液中更昔洛韦和杂质含量 %

表4 各破坏试验条件下更昔洛韦峰纯度结果

2.4 线性方程、检出限、定量限

取杂质系列混合标准工作溶液和更昔洛韦系列标准工作溶液，按1.2 色谱条件进行测定，以更昔洛韦与各已知杂质样品溶液浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算回归方程和相关系数。取系统适用性溶液和杂质A，B，C，E，F 定位溶液，逐级稀释，以3 倍的信噪比计算检出限，以10 倍的信噪比定量限，按1.2 色谱条件进行测定。线性范围、线性方程、相关系数、定量限和检出限列于表5。

表5 线性范围、线性方程、相关系数、定量限和检出限

2.5 响应因子的计算

依据2.4 线性测试结果，更昔洛韦与杂质A、杂质B、杂质C、杂质E 和杂质F 的线性回归方程斜率即为在不同浓度下测得峰面积与进样浓度比值，再计算各已知杂质斜率与更昔洛韦斜率比值即为相对主成分的校正因子，更昔洛韦与各已知杂质A、杂质B、杂质C、杂质E 和杂质F 的校正因子分别为1.0，1.0，1.3，1.0，1.0 和0.7，其中杂质B 和杂质F 的校正因子超出0.9～1.1 范围，说明杂质B和杂质F与主成分更昔洛韦在液相色谱上的响应差异较大，应改用杂质对照品按照外标法进行定量更为准确。

2.6 精密度试验

取同一批注射用更昔洛韦（批号：2017-1t），按1.3 方法制备供试品溶液和对照溶液，配制6 份，按照1.2 色谱条件进行测定，结果列于表6。

表6 精密度试验结果 %

由表6 可知，6 份样品中杂质A 和杂质B 均未检出，杂质C、杂质D、杂质E 和杂质F 均有检出，相对标准偏差均小于2.0%，表明方法精密度良好。

2.7 准确度试验

取同一批注射用更昔洛韦对照品溶液9 份，平均分为3 组；分别精密移取混合杂质储备工作溶液5，10，15 mL 各3 份，依次置入上述3 组容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，配制成回收率供试品溶液；再精密吸取杂质储备工作溶液2 mL，置入20 mL 量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为杂质对照品溶液；精密量取上述回收率供试品溶液和杂质对照液各20μL，按上述色谱条件进行测定，按外标法计算回收率，结果列于表7。

表7 杂质A、杂质B、杂质C、杂质E 及杂质F 准确度试验结果

由表7 可知，杂质A、杂质B、杂质C、杂质E和杂质F 的平均回收率为99.5%～105.0%，均小于3.0%，表明该方法准确度良好。

2.8 溶液稳定性试验

取系统适用性溶液于室温下放置，按1.2 色谱条件分别于0，2，4，6，8，12 h 进行测定，考察主峰及各已知杂质峰面积变化情况，结果列于表8。

表8 溶液稳定性试验结果

由表8 可知，系统适用性溶液室温放置12 h，更昔洛韦及各已知杂质峰面积无明显变化，相对标准偏差均小于3%，表明对照溶液室温下放置12 h，稳定性良好。

2.9 耐受性试验

取系统适用性溶液，对该方法的耐受性进行考察。在流量为1.5 mL／min，柱温为40℃，流动相为0.05%三氟乙酸溶液-乙腈（50∶50）基础上，将流量改为1.4 mL／min 和1.6 mL／min，柱温改为38℃和42℃，流动相比例改为0.05%三氟乙酸溶液-乙腈（55∶45）和0.05%三氟乙酸溶液-乙腈（45∶55），色谱柱改为HICHROM PARTISIL（10 μm SCX，4.6×250 mm，Lot No：E2117），分别考察了系统适用性溶液中主峰与相邻杂质E 以及各杂质之间分离情况。

试验结果表明各种条件下主峰与杂质E 分离度均为1.7，大于1.5，未发生明显变化，符合分离度要求，杂质B 与杂质C 之间分离度最小为1.4，也达到分离基线。调整色谱条件，出峰顺序未发生改变，依次为杂质A，B，C，D，E、更昔洛韦及杂质F，结果表明各种色谱参数波动不影响有关物质测定。该方法耐受性良好，适用于注射用更昔洛韦有关物质 检测。

2.10 样品测定

按所建方法，对3 批注射用更昔洛韦和2 批更昔洛韦原料中的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E 和杂质F 进行测定，结果见表9。

表9 注射用更昔洛韦和原料杂质测定结果 %

3 结语

建立高效液相色谱法同时测定注射用更昔洛韦和原料中6 中已知杂质含量的测定方法，该方法简单快捷，专属性强，精密度好，可用于注射用更昔洛韦和原料中更昔洛韦和杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E 和杂质F 含量的检测，为更好地控制更昔洛韦原料及制剂的质量提供了参考依据。