猪链球菌rpoE基因克隆及生物信息学分析

2020-07-28杜炎斌张港琛王瑜欣刘宝宝宫胜龙

浙江农业学报 2020年7期

杜炎斌，张港琛，王瑜欣，刘宝宝，宫胜龙，东笑，汪洋

(河南科技大学动物科技学院洛阳市畜禽分子病原与免疫学重点实验室，河南洛阳 471003)

猪链球菌是一种重要的人畜共患病原体，严重危害养殖业和人类健康[1]。其中，猪链球菌2型毒力较强，在欧洲、北美洲以及亚洲均有报道，在世界范围内分布广泛[2]。猪链球菌感染动物后，导致机体出现败血症、肺炎及脑膜炎症状，病情严重时突然死亡。人感染猪链球菌后，主要表现为脑膜炎、心内膜炎、听力丧失，严重者可出现中毒休克综合征(STSS)[3]。

rpoE基因编码的RpoE被认为是无乳链球菌等多种原核生物进行环境适应的重要调控因子，当机体处于胁迫状态如温度酸碱等胁迫环境，rpoE通过调控部分基因表达以适应环境变化[4-6]。RpoE蛋白对于维持周质和外膜的蛋白质表达十分重要，并且RpoE具有良好的免疫原性，被认为有成为疫苗的潜力，属于胞质外功能蛋白家族[7-8]。研究表明，牙龈卟啉单胞菌中部分毒力基因表达受rpoE调节[9]。Humphreys等[10]通过实验证实，rpoE基因缺失后沙门氏菌在小鼠模型中定植能力显著下降、毒力降低。此外，有研究表明，rpoE基因与生物被膜形成有关，无乳链球菌ΔrpoE菌株葡聚糖结合蛋白(GbpC)基因表达下调，而GbpC被认为对于生物被膜中胞外多糖基质的形成十分重要[4]。

目前，关于猪链球菌rpoE基因的研究较少，特别是生物信息学方面鲜有报道。因此，本研究利用生物信息学方法对猪链球菌rpoE基因及RpoE蛋白进行系统性分析，以期为相关基因工程疫苗的研发与后续研究rpoE提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 猪链球菌rpoE基因克隆

根据猪链球菌ZY05719菌株rpoE基因序列(登录号：AKG39741.1)，设计扩增引物，分别为rpoE-F：5′-cccgtgctattttggaagaa-3′和rpoE-R：5′-catgaacgtaagccccattt-3′，引物由上海睿勉生物技术有限公司合成。以猪链球菌基因组为模板对rpoE目的基因进行扩增，扩增产物回收后连接pMD18-T载体，转化至大肠埃希菌DH5α细胞，在含有Amp抗性的平板上进行筛选后，将扩增产物送上海睿勉生物技术有限公司进行测序。

1.2 生物信息学分析

通过ProtParam在线程序(https://web.expasy.org/protparam/)进行RpoE蛋白理化性质分析，包括理论等电点pI、分子质量、稳定性，及半衰期指数等。对RpoE蛋白的保守结构域分析使用NCBI的CDD程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；使用TMPred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)和TMHMM软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)联合分析RpoE的跨膜区域；关于RpoE蛋白是否存在信号肽的预测使用SignalIP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行[11]；使用PSORTb程序(https://www.psort.org/psortb/)进行亚细胞定位分析。预测RpoE蛋白N、O两种糖基化及磷酸化位点的存在，同时通过IEDB(http://tools.immuneepitope.org/main/)预测其优势B细胞抗原表位。此外，RpoE蛋白三级结构的预测在SWISS-MODEL程序进行(https://swissmodel.expasy.org/)。最终，通过String(https://string-db.org/)在线程序预测RpoE与其他蛋白互作关系，并结合相关文献分析其调控机制[12]。

2 结果与分析

2.1 rpoE基因克隆

重组质粒pMD18-T-rpoE测序结果表明，rpoE基因全长582 bp。

2.2 RpoE蛋白质的理化性质

Protstparam程序分析认为，rpoE基因编码的RpoE蛋白分子式为C954H1430N240O368S4，由193个氨基酸组成，其中带负电荷氨基酸数比带正电荷数多53个。其理论分子质量为2.227748×104u，理论等电点为3.73。RpoE不稳定指数为53.52，消光系数为24 410，属于不稳定蛋白。RpoE蛋白在体外哺乳动物网织红细胞、酵母和大肠埃希菌体内半衰期大约为30、20和10 h。

2.3 跨膜结构域、信号肽及亚细胞定位

RpoE蛋白的跨膜区使用TMHMM和TMpred联合分析，TMpred与TMHMM分析表明其肽链中不存在跨膜氨基酸，因此，认为RpoE可能是一种胞质蛋白。SingaIP 4.1软件预测结果显示，未发现信号肽。通过PSORTb v3.0程序进行亚细胞定位分析，RpoE最终预测定位在胞质中得分为7.5，综合分析认为RpoE可能属于胞质蛋白。

2.4 糖基化、磷酸化位点及保守结构域分析

通过NetNGlyc 1.0和Netphos 3.1分析RpoE蛋白磷酸化与糖基化位点。结果表明，RpoE蛋白中存在磷酸化丝氨酸位点11个，磷酸化络氨酸位点5个，磷酸化苏氨酸位点2个(图1)，序列中不存在糖基化位点。

图1 RpoE磷酸化位点分析Fig.1 Phosphorylation site of RpoE protein

通过NCBI的CDD程序分析，发现RpoE蛋白存在4个保守域结构，分别命名为COG3343、PRK02363、pfam05066和TIGR04567，均属于HARE-HTH超家族成员。

2.5 抗原表位分析

利用IEDB程序进行RpoE蛋白B细胞抗原表位分析。RpoE蛋白表面可及性采用Emini法预测，得分较高区域分别为8-15、24-34、43-52、95-113、140-157和179-189位氨基酸(图2-A)。用Parker法进行蛋白亲水性分析，得分较高区域主要集中在后半段，分别为6-15、24-34、94-123、125-136、139-165和166-193位氨基酸(图2-B)。使用Karplus-Schulz法分析RpoE可塑性，发现前半部分布较均匀，高可塑性区域主要集中靠近C端侧，分别为5-16、23-34、44-55、95-113、124-165和166-179位氨基酸(图2-C)。RpoE蛋白抗原性使用Kolaskar & Tongaonkar在线分析，结果显示，RpoE氨基酸序列平均抗原指数为0.980，抗原指数较高的区域为11-28、51-71、78-90、133-145和184-193位氨基酸(图2-D)。

A，Emini表面可及性预测；B，Parker亲水性预测；C，Karplus & Schulz可塑性预测；D，Kolaskar & Tongaonkar抗原性预测。A，Emini surface accessibility prediction; B，Parker hydrophilicity prediction; C，Karplus & Schulz plasticity prediction; D，Kolaskar & Tongaonkar antigenic prediction.图2 B细胞抗原表位预测Fig.2 B cell antigenic epitope of RpoE protein predicted by IEDB

对RpoE编码肽链表面可及性、亲水性、可塑性和抗原性综合分析，并结合蛋白二级结构特点进行筛选，认为优势B细胞抗原表位大体应满足如下指标，序列位于无规则卷曲区域内，氨基酸数目在5～15，以及表面可及性指数≥1.0，可塑性指数≥1.015，亲水性指数≥3.210，抗原性指数≥0.980，最终筛选出 5个优势B细胞抗原表位，具体序列见表1。

表1 RpoE优势B细胞抗原表位氨基酸序列

2.6 蛋白结构与互作

蛋白二级结构综合分析结果表明，RpoE蛋白中存在108个α-螺旋，占比为52.3%；其余由66个无规则卷曲、7个β-转角和15个延伸链组成，比例分别为36.3%、7.8%、和3.6%。通过SWISS-MODEL软件完成RpoE蛋白三级结构模型的构建(图3-A)。观察到较多的无规则卷曲和α-螺旋，与二级预测结果较一致。但GMQE评价模型可靠性得分为0.3，表明该模型可信度一般。

RpoE与其他蛋白间相互作用关系通过STRING程序进行分析，显示存在10个蛋白与RpoE间存在相互作用(图3-B)，其分别为RpoZ、RpoB、RpoA、RpoC、folE、PyrG、PnP、SSU05_2118、SSU05_0839和SSU05_0544。与RpoE相互作用网络相关的生物学通路主要包括RNA代谢及转录、芳香族化合物及其他环状化合物合成过程。

图3 RpoE蛋白三级结构预测(A)及蛋白互作网络分析(B)Fig.3 Tertiary structure prediction (A) and protein interaction network analysis (B) of RpoE protein

3 讨论

猪链球菌对养殖业健康发展造成威胁。目前，主要通过使用抗生素和早期疫苗接种进行猪链球菌病的防控；然而，大量抗生素的使用加剧耐药性的产生，另一方面由于猪链球菌血清型众多，商品化疫苗存在交叉免疫保护效果欠佳的问题[13]。因此，猪链球菌相关疫苗的研究仍不断深入。相关研究表明，使用猪链球菌某些表面毒力因子及相关分泌蛋白作为亚单位疫苗，对于猪链球菌感染具有一定的免疫保护作用。

研究人员通过转录组、蛋白组学实验证明，rpoE基因与无乳链球菌毒力相关，认为其具有一定的研究价值[10，14]。本研究通过生物信息学方法对rpoE基因进行分析，其编码由193个氨基酸组成、理论等电点为3.73的亲水性蛋白，根据结构与生物特性预测结果分析，RpoE为含有存在限制性内切酶HTH结构域的胞质蛋白，一般认为具有该结构域的蛋白在生物体内主要对DNA转录起调控作用[15]。研究人员研究鼠伤寒沙门氏菌转录组发现，RpoE直接或间接调控超过半数以上基因[16]。此外，我们使用IEDB对该蛋白抗原表位进行预测，综合考虑可及性、可塑性、抗原性和亲水性特点，预测其存在5个B细胞抗原表位，认为其能够诱导B细胞产生抗体，具有作为疫苗的潜力。

通过预测发现RpoE上存在较多磷酸化位点，考虑其可能在信号转导中发挥作用，使用String程序分析蛋白互作关系，并结合相关文献分析获知细菌内可能存在多种RpoE调控网络(图4)。rpoE基因上游存在多个启动子，RseA为RpoE的负调控元件，当机体处于胁迫环境时，RseA蛋白水解，最终产生大量RpoE进行应激响应[17]。此外，RpoE还存在另一种调节方式，即鸟苷四磷酸ppGpp与多个小分子RNA的联合调控[18]，ppGpp是维持细菌基因组完整的关键分子[19]。特殊环境中，鸟苷四磷酸能够激活rpoE的转录，rpoE一定程度上间接增加CsrB、CsrC的转录，继而减少CsrA翻译(CsrA对rpoE转录起抑制作用)，通过一系列反馈调节，RpoE表达增多，从而完成对包膜的损伤修复[20]。