曾文静，陈奋奇，庄泽龙，丁永福，彭云玲

(甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070)

干旱是玉米(ZeamaysL.)生长发育中受到的主要非生物胁迫。当植物受到干旱胁迫时，甜菜碱(GB)或脯氨酸(Pro)作为渗透调节物质参与植物细胞的渗透调节，降低水势，保持膨压，抵御干旱。GB是一种天然无毒的渗透相溶性物质，普遍存在于动植物和微生物体内，在抗逆性方面具有重要作用，例如渗透调节、清除活性氧、维持生物膜的稳定性、保护光合机构、维持大分子蛋白复合物和某些酶的结构和功能等[1]。GB可以通过自身合成积累，也可通过叶片喷施、根施、浸种等方式来提高植物的抗逆性。叶面喷施适宜浓度GB可显著提高棉花[2]、匍匐翦股颖[3]的耐旱性；将GB施用于玉米根部可增加其高度、叶面积和总干重[4]。Pro是植物在逆境下积累的一种小分子的渗透物质，水分和盐胁迫时Pro含量可以增加数十倍甚至上百倍，在调节渗透势、维持大分子结构的稳定性以及清除活性氧的过程中起重要作用[5]。目前关于外源GB或Pro单方面对作物耐旱性的影响已有研究[1-8]，但外源GB和Pro对干旱缓解效果的差别尚不清楚，在烟草BY-2细胞[9]和水稻[10]上的研究表明，外源Pro比外源GB更能缓解盐胁迫产生的不利影响，而在干旱胁迫下是否具有相同的结论，同时现有研究大多是针对同一品种或不同干旱胁迫强度或某一特定的时间点进行的，少有针对耐旱性不同作物品种的缓解效果进行研究。

在水分缺乏的情况下作物可以通过改变自身的形态结构最大限度地使细胞水势保持在最有利于生长发育的范围内[11]，而叶片在这一应激机制中发挥着重要作用。干旱胁迫下植株光合作用下降，主要是由叶片对光能和CO2的利用率下降而引起的，作为CO2和H2O等物质交换的重要通道，气孔的变化直接决定着作物的蒸腾与光合速率。针对气孔性状及其抗旱性的研究已有报道，于海秋等[12]的研究表明，玉米叶片气孔在干旱胁迫下密度增大，而宽度和长度则明显减小。高彦萍等[13]发现水分胁迫使大豆叶片气孔密度增加，气孔开度和单位叶面积气孔相对面积减小。然而就不同耐旱性玉米自交系的气孔差异以及对干旱胁迫的响应差异鲜见报道。玉米叶片具有C4植物特有的花环型结构，花环型结构由维管束鞘细胞和围绕着鞘细胞的叶肉细胞两部分整齐排列构成。维管束鞘细胞不仅提高CO2的利用率，而且可以通过调节气孔开度以控制水分平衡[14]。Ache等[15]的研究表明，叶片的径向水流不仅受到气孔的调节，同时还受到维管束导管的影响。Pardo等[16]认为，气孔运动和维管系统到内部组织的水分供应对叶片水势的稳定有重要作用。因此，植物叶片的气孔运动和维管束结构在应对干旱胁迫、保证叶片水势稳定的机制中具有重要功能。然而在水分胁迫下不同耐旱性玉米自交系叶片在维管束、气孔运动和花环型结构变化方面具有怎样的差异，以及三者之间的关系目前尚不清楚。

本研究以玉米耐旱自交系昌7-2和旱敏感自交系TS141为试材，以20%聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫，在苗期添加不同浓度的外源GB或Pro，筛选最佳缓解浓度，从生理特性、气孔特性以及细胞解剖学结构三方面研究外源GB或Pro对玉米干旱胁迫的缓解能力，比较二者缓解效应的差别，同时对不同耐旱性玉米自交系叶片在干旱胁迫下的细胞解剖学差异进行比较，以期为提高玉米耐旱性方面的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

以本课题组前期筛选出的玉米耐旱自交系昌7-2(属唐四平头系)和旱敏感自交系TS141(属Reid系)为试验材料[17]，两个品种均由甘肃农业大学农学院玉米课题组提供。

1.2 试验方法

1.2.1 种子预处理 挑选饱满一致、无损伤的TS141种子，经0.5% NaClO消毒10 min后用蒸馏水冲洗干净, 于25℃下在对应处理液中吸胀24 h。对照组记为CK+(蒸馏水)，处理组记为CK-(20%PEG)，5个梯度的GB或Pro溶液浓度分别为：T1(20%PEG+10 μmol·L-1GB)，T2(20%PEG+20 μmol·L-1GB),T3(20%PEG+30 μmol·L-1GB)，T4(20%PEG+40 μmol·L-1GB),T5(20%PEG+50 μmol·L-1GB)；T1*(20%PEG+200 μmol·L-1Pro)，T2*(20%PEG+400 μmol·L-1Pro),T3*(20%PEG+600 μmol·L-1Pro)，T4*(20%PEG+800 μmol·L-1Pro),T5*(20%PEG+1 000 μmol·L-1Pro)。

1.2.2 幼苗生长试验 将CK+、CK-、T1～T5、T1*～T5*溶液浸种后的TS141种子各30粒，分别播种于装有灭菌蛭石的方形营养钵(长×宽：15 cm×13 cm)中，每个营养钵各10粒，置于昼/夜温度为25℃/20℃的人工气候培养箱中培养，每天光照14 h，黑暗10 h，光照强度600 μmol·s-1·m-2，相对湿度60%～80%。每隔1 d加入50 mL蒸馏水，每3 d施加50 mL对应处理液。以CK+为标准，待植株生长至三叶期，将幼苗根系附着的蛭石冲洗干净，吸干幼苗表面残余水分，测定生长参数以及生理指标。比较经过不同处理后各植株的生理生化指标，筛选出苗期最佳外源调节物质的处理浓度。再按照种子预处理以及幼苗生长试验方法，分别在CK+、CK-以及最佳外源调节物质处理浓度下培养耐旱自交系昌7-2和旱敏感自交系TS141，测定其苗期生长参数、生理指标及气孔特性，并制备叶片组织切片。

1.3 指标测定

1.3.1 生长参数测定 根长、苗长的测定：幼苗的株高和主根长用直尺测量。鲜重与干重的测定：将单株地下部和地上部分离后称重。称重后置于烘箱于105℃杀青30 min，80℃烘干至恒重后称其干重。试验设置3次重复。

1.3.2 幼苗生理指标测定 根据Galmés等[18]方法测定相对含水量(relative water content, RWC)；用浸泡法测定相对电导率(relative conductivity, RC)[19]，使用氮蓝四唑光化学还原法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性[20]，过氧化物酶(peroxidase, POD)活性、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性用愈创木酚比色法测定[21-22]，可溶性糖含量(soluble sugar content, SS)用蒽酮硫酸比色法测定[23]，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量测定使用硫代巴比妥酸显色法[24]，脯氨酸(Proline, Pro)含量测定采用茚三酮显色法[25]。试验设置3次重复。

1.3.3 叶片气孔形态测定 参照Yu等[26]叶片表面压印法，制作不同处理玉米植株第三片叶大致相同部位的上表皮切片，在光学显微镜(Leica 6000; Leica Instruments, Germany)下分别观察6个视野并拍照，用ImageJ软件测量叶片气孔长度、气孔宽度、气孔面积、气孔数量和气孔开度。

1.3.4 叶片组织切片制备 采用Schuerger等[27]的番红-固绿染色法，制作不同处理下玉米第三片叶相同部位横切面切片，粘片时采用蛋清甘油混合溶液(v∶v=1∶2)。制作完成的切片置于光学显微镜(Olympus, BX61, Japan)下进行观察并拍照。

1.4 数据统计与分析

使用SPSS 19.0统计软件(SPSS Inc., Chicago, USA)进行数据分析，采用Duncan法对各处理之间进行差异显著性分析，试验结果均用平均值±标准偏差(standard deviation, SD)表示；采用Microsoft Excel 2013作图。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下外源调节物质对玉米幼苗生长及生理生化特性的影响

旱敏感自交系TS141的生长参数在不同处理下存在差异(图1)。干旱胁迫处理下，干旱敏感自交系TS141的苗长、根长、地上部鲜重和地下部鲜重分别降低了21.42%、34.40%、38.70%、38.67%。而添加外源GB或Pro有效缓解干旱胁迫的效果，较CK-处理相比，其各生长参数均显著升高(P<0.01)，但不同浓度外源GB或Pro对生长参数的缓解程度不同(图1)。就外源GB而言，T3处理玉米苗长、根长、地上部鲜重和地下部鲜重达到最大，分别是CK-干旱胁迫处理的1.26、1.54、1.51、1.46倍；而T5处理玉米苗长和地下部鲜重达最小，分别是CK-干旱胁迫处理的1.09、1.08倍。T1处理玉米根长和地上部达最小，分别是CK-干旱胁迫处理的1.03、1.13倍。就外源Pro而言，T2*处理玉米的苗长、根长、地上部鲜重和地下部鲜重达到最大，分别是CK-干旱胁迫处理的1.15、1.39、1.13、1.52倍；而T5*处理玉米的苗长、根长、地上部鲜重和地下部鲜重达最小，分别是CK-干旱胁迫处理的0.92、0.91、0.79、1.02倍。

旱敏感自交系TS141的生理特性在不同处理下存在差异(图2)。CK-干旱胁迫处理时，玉米幼苗的相对含水量明显下降，与CK+对照处理相比降低了18.60%；其他7个生理性状如相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、CAT活性、可溶性糖含量、SOD活性、POD活性等则显著上升，分别是对照处理的1.82、2.27、3.07、1.73、1.42、2.19、2.59倍。干旱胁迫下添加外源GB或Pro对玉米幼苗的生理生化特性有明显的影响，且不同浓度外源GB或Pro对各生理生化性状的影响程度不同(图2)。就外源GB而言，T5处理玉米相对含水量达到最大，是CK-干旱胁迫处理的1.14倍；T3处理玉米的相对电导率、丙二醛和脯氨酸含量、3种保护酶(SOD、POD或CAT)活性以及可溶性糖含量达最小，与CK-干旱胁迫处理相比分别下降了38.70%、48.00%、30.43%、27.49%、16.77%、37.38%、42.12%。就外源Pro而言，T2*处理玉米的相对含水量达到最大，是CK-干旱胁迫处理的0.98倍；T1*或T2*处理玉米的相对电导率、丙二醛和脯氨酸含量、3种保护酶(SOD、POD或CAT)活性以及可溶性糖含量达最小，与CK-干旱胁迫处理相比分别下降了40.95%、48.00%、22.87%、31.75%、-42.92%、25.95%、32.1%。

图2 干旱胁迫下GB 或 Pro对玉米自交系TS141幼苗生理特性的影响Fig.2 Effects of different exogenous regulating substances (GB or Pro) in maize inbred line TS141 seedling physiological characteristics

由此，就玉米幼苗的长势和生理性状而言，外源GB在T3(30 μmol·L-1)处理时对玉米干旱胁迫缓解效应最佳，外源Pro在T2*处理时对玉米干旱胁迫缓解效应最佳。

2.2 干旱胁迫下最佳浓度外源调节物质对不同耐旱性玉米幼苗的缓解效应分析

2.2.1 最佳浓度外源调节物质对玉米生长参数和生理特性的影响 干旱胁迫下两种耐旱性不同玉米自交系的生长表现存在差异(图3)。昌7-2和TS141的苗长和根长在干旱胁迫下均显著降低，昌7-2分别降低了19.45%、25.08%，TS141分别降低了25.65%、43.88%；而在地上部鲜重和地下部鲜重方面，昌7-2未出现显著差异，TS141则分别降低了68.67%、44.90%，即干旱敏感自交系TS141在苗长、根长、地上部及地下部鲜重降幅均大于耐旱自交系昌7-2。添加最佳浓度外源GB或Pro后对干旱胁迫有明显的缓解效应，与CK-处理相比，其各生长参数均有所上升(P<0.01)，但同一外源调节物质对不同自交系缓解效果不同(图3)：与CK-相比，外源GB处理后昌7-2苗长、地上部及地下部鲜重均无显著性差异，而TS141的各生长参数均显著上升，分别是CK-的1.30、1.39、2.88、1.48倍；与CK-相比，外源Pro处理后昌7-2只有根长出现显著差异，而

注：不同小写字母代表同一自交系在不同处理下差异显著(P<0.01)。下同。Note:Different lowercase letters in the same inbred line indicate significant difference (P<0.01). The same below.图1 干旱胁迫下GB 或 Pro对玉米自交系TS141幼苗生长的影响Fig.1 Effects of GB and Pro on seedling growth of maize inbred line TS141 under drought stress

图3 干旱胁迫下最佳浓度GB 或 Pro对两种玉米自交系幼苗生长的影响Fig.3 Effects of optimum concentration of exogenous regulating substances (GB or Pro) in maize seedling growth parameters

TS141的根长、地上部及地下部鲜重显著升高，分别是CK-的1.43、2.13、1.52倍，即外源调节物质对干旱敏感自交系TS141的缓解效果比对耐旱自交系昌7-2明显。同时不同外源调节物质对同一自交系的缓解效果不同(P<0.01)(图3)，外源GB处理后TS141比CK-各生长参数均显著升高，外源Pro处理后则只有根长、地上部及地下部鲜重显著升高，即与外源Pro相比，外源GB的缓解效果较好。

干旱胁迫下玉米幼苗体内代谢紊乱，不同处理相对含水量呈现先降后升趋势，其他生理指标呈现先升后降趋势。干旱胁迫下耐旱自交系昌7-2和旱敏感自交系TS141在生理特性方面存在差异(图4)。昌7-2相对含水量在各处理下均未出现显著差异，而TS141在干旱胁迫下下降26.77%；两自交系相对电导率、丙二醛含量在干旱胁迫下显著升高，昌7-2分别是CK-的1.27、1.55倍，TS141分别是CK-的1.39、1.68倍，即耐旱自交系昌7-2在相对电导率及丙二醛含量的上升幅度小于旱敏感自交系TS141；两自交系Pro含量、SOD活性、POD活性、CAT活性及可溶性糖含量在干旱胁迫下同样显著升高，昌7-2的分别是CK-的2.92、1.64、1.32、4.62、2.35倍，TS141的分别是CK-的2.58、1.41、1.73、4.42、1.96倍，即耐旱自交系昌7-2在这5个生理指标的上升幅度大于旱敏感自交系TS141。干旱胁迫下添加外源GB或Pro对玉米幼苗的生理特性有显著影响(P<0.01)，可显著缓解干旱胁迫伤害，但与生长参数类似，同一外源调节物质对不同耐旱性自交系的缓解效果不同(图4)：就外源GB而言，与CK-相比脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、CAT活性在两自交系中均出现显著差异，昌7-2分别降低了47.01%、26.33%、15.00%、66.08%，TS141分别降低了46.22%、16.58%、35.24%、60.52%；就外源Pro而言，与CK-相比脯氨酸含量、POD活性、CAT活性及可溶性糖含量在两自交系中均出现显著差异，昌7-2的分别降低了27.74%、11.45%、44.32%、19.83%，TS141的分别降低了43.55%、29.87%、50.40%、47.86%，与耐旱自交系昌7-2相比，外源调节物质对旱敏感自交系TS141的缓解效果较明显。同时也发现不同外源调节物质对同一材料的缓解效果不同(图4)，昌7-2脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、CAT活性在添加外源GB或Pro后与CK-相比均显著下降(P<0.01)，最佳浓度外源GB处理下分别下降47.01%、26.33%、15.00%、66.08%，最佳浓度外源Pro处理下分别下降27.74%、17.65%、11.45%、44.32%，即添加外源GB对玉米的缓解幅度大于外源Pro，外源GB缓解效果较好。

2.2.2 添加最佳浓度外源调节物质对玉米叶片气孔形态和数量的影响 正常供水条件下耐旱自交系昌7-2和旱敏感自交系TS141在5个气孔性状间存在差异(表1)。干旱敏感自交系TS141的气孔长度、宽度、面积及开度整体大于耐旱自交系昌7-2，而单位面积气孔数量则小于耐旱自交系昌7-2。干旱胁迫下两玉米自交系叶片气孔长度、宽度、面积及开度均减小，单位面积气孔数量则增加，但两自交系变化幅度不同(P<0.05)。干旱胁迫下昌7-2气孔各项特征均出现显著差异，气孔长度、宽度、面积及开度与对照相比分别减少了10.11%、12.76%、13.10%、23.78%，气孔数量上升了14.89%；而TS141只有气孔宽度和开度出现显著差异，分别减少了5.15%、17.80%，变化幅度均低于昌7-2。两自交系气孔宽度的变化幅度均大于气孔长度的变化幅度，说明干旱胁迫下气孔形状的变化主要是气孔宽度的减小。添加外源GB或Pro后对气孔特性有明显的缓解效应，且同一外源调节物质对两自交系的缓解效应不同(P<0.05)。与CK-相比昌7-2添加外源GB后气孔长度、面积、开度均显著上升，而TS141只有气孔宽度显著上升；与CK-相比添加外源Pro后昌7-2气孔开度显著上升，而TS141各气孔参数与CK-相比均无显著差异，即就气孔形状与数量而言，外源GB或Pro对玉米耐旱自交系昌7-2缓解效果较强，并且添加外源GB或Pro对同一自交系的缓解效果不同，外源GB对叶片气孔形状和数量的缓解效果强于外源Pro，外源Pro在气孔形状和数量方面基本没有表现出缓解效应。

表1 干旱胁迫下最佳浓度GB或Pro对两种玉米自交系叶片气孔参数的影响

2.2.3 添加最佳浓度外源调节物质对玉米叶片解剖结构的影响 在作物生长发育过程中，植株通过不同形态结构应对不同生物胁迫和非生物胁迫[28]。干旱胁迫下两玉米自交系木质部导管直径变小，形状趋向于不规则，由接近圆形转变为接近多边形；大维管束断面面积减小(见图5)。干旱胁迫下耐旱自交系昌7-2叶绿体由紧贴细胞质膜内侧分布趋于整体向偏细胞中心移动，而TS141中只有个别叶绿体分布发生了变化。干旱敏感自交系TS141在干旱胁迫下花环型结构变形且排列凌乱，维管束鞘细胞和韧皮部细胞排列散乱且不清晰，昌7-2则未发现明显差异。就玉米叶片解剖结构而言，添加外源GB和Pro对耐旱性玉米自交系昌7-2的缓解效应基本无差别。添加外源GB后干旱敏感自交系TS141叶片细胞结构明显恢复且排列整齐，即外源GB对TS141的缓解效应强于外源Pro。

注：1：厚壁组织;2：维管束鞘细胞;3：叶肉细胞;4：木质部;5：韧皮部;6：叶绿体。A：昌7-2；B：TS141。a:CK+;b:CK-;c:T3；d：T2*。Ⅰ：大维管束;Ⅱ：小维管束。Note: 1: Sclerenchyma; 2: Bundle sheath cell; 3: Mesophyll cell; 4: Xylem; 5: Vascular bundles; 6: Chloroplast. A: Chang 7-2; B: TS141. a: CK+; b: CK-; c: T3; d: T2*. Ⅰ: Big vascular bundles; Ⅱ: Small vascular bundles．图5 干旱胁迫下添加最佳浓度外源调节物质对两种玉米自交系叶片解剖结构的影响Fig.5 Effects of optimum concentration of exogenous regulating substances (GB or Pro) in maize seedling leaf anatomical structure

3 讨 论

玉米对干旱尤其敏感，水分胁迫是玉米产量的主要限制因素[29]。虽然玉米苗期需水量低于生长后期，但干旱胁迫会影响玉米在早期作物建立阶段的适应性，限制玉米生长产量潜力[30]。玉米苗期供水不足会影响叶片生长发育，从而导致光合作用速率下降等一系列影响。干旱胁迫下施加外源GB或Pro有助于细胞抵御逆境胁迫的不利影响，本试验通过对玉米幼苗生长参数和生理性状分析发现，外源GB在浓度为30 μmol·L-1(T3)时对玉米干旱胁迫缓解效应最佳，外源Pro在浓度为400 μmol·L-1(T2*)时对玉米干旱胁迫缓解效应最佳。

干旱胁迫下玉米耐旱自交系昌7-2和干旱敏感自交系TS141均出现形态应激，但昌7-2与对照相比几乎无差异，而TS141则出现显著抑制生长的现象，例如根长几乎缩短了50%。幼苗叶片脂膜过氧化程度、活性氧清除及渗透调节能力均增强，但耐旱自交系昌7-2的相对电导率及丙二醛含量上升幅度小于干旱敏感自交系TS141，而脯氨酸含量上升幅度大于TS141，说明昌7-2在干旱胁迫下能相对保持膜系统的稳定性，质膜过氧化程度较TS141轻。昌7-2在干旱胁迫下SOD、POD、CAT活性及可溶性糖含量上升幅度大于TS141，也说明了昌7-2清除应激诱导产生的活性氧及过氧化物的能力较强，能更好地维持细胞稳态。添加最佳浓度的外源GB或Pro对幼苗特性有显著影响，本试验表明，外源GB或Pro对耐旱性不同的玉米自交系均产生了缓解效应，苗长、根长、地上部鲜重及地下部鲜重明显上升，各生理指标与对照相比差异明显减少。结合生理特性、气孔运动以及叶片细胞学观察发现，外源GB的缓解效果强于外源Pro，且不同玉米自交系对外源GB或Pro的敏感性不同，耐旱性越弱的玉米品种对外源GB或Pro越敏感。

本研究对玉米苗期叶片干旱胁迫下的花环型结构进行了观察，结果发现旱敏感自交系TS141花环型结构变形且排列凌乱，维管束鞘细胞和韧皮部细胞排列散乱且不清晰；耐旱自交系昌7-2叶绿体分布向偏细胞中心扩散；两自交系木质部导管直径均减小，形状由接近圆形转变为接近多边形，同时大维管束断面面积减小。花环型结构只存在于C4植物中，该结构的存在造就C4植物独特的CO2浓缩机制，使C4植物对CO2的固定效率比C3植物高很多[31]，有利于玉米在干旱环境的生长。现有研究表明维管束鞘细胞在保持叶片水势方面扮演着重要角色[32]，干旱胁迫导致维管束鞘细胞排列凌乱且不紧凑，使其与周围细胞的接触面积减小，进而造成玉米光合作用效率下降[33]；叶绿体分布的变化可能是玉米叶片适应干旱胁迫，增加光吸收面积的一种机制[32]；叶片木质部导管是植物进行蒸腾作用、运输水分的重要途径，本研究中耐旱自交系昌7-2和旱敏感自交系TS141木质部导管均出现直径减小现象，可能会降低通过木质部导管到达叶表面以进行蒸腾作用的水分量，使叶片导管系统水势降低，诱导玉米叶片气孔开度降低，以适应干旱环境。

气孔作为植物体物质内外交换的重要通道，其变化也是逆境胁迫下的重要适应机制之一。本研究在不同处理下敏感自交系TS141气孔长度、宽度、面积及开度整体大于耐旱自交系昌7-2，而单位面积气孔数量则小于耐旱自交系昌7-2，说明耐旱性越强的玉米自交系品种其叶片气孔越趋向于个体小且分布密集。干旱胁迫下两玉米自交系的气孔面积均减小，而单位面积气孔数量则增加，推测玉米适应干旱胁迫的机制之一可能是水分胁迫使叶面积减小从而提高了单位叶面积上的气孔个数，这与于海秋等[12]的研究一致；同时两自交系的气孔开度在干旱胁迫下减小，可能是减少叶片蒸腾失水以应对干旱胁迫，虽然同时也增大了CO2进入细胞的阻力，但玉米作为典型的C4植物，其特有的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶与CO2极高的亲和力，使得C4植物有极少的CO2存在时，维管束鞘细胞就能快速高效地进行光合作用[34]。干旱胁迫下耐旱自交系昌7-2各气孔参数变化幅度显著大于旱敏感自交系TS141，可能是昌7-2比TS141耐旱性强的原因之一。另外，就气孔运动而言，外源GB的缓解效果强于外源Pro，这与其生理特性一致。