贺 维 龙 婷 张艺馨 秦光成 陈力学 周冀英

（1 重庆医科大学附属第一医院实验研究中心，重庆400016；2 重庆市神经病学重点实验室，重庆400016）

慢性偏头痛 (chronic migraine, CM) 是偏头痛的一种严重亚型，通常由发作性偏头痛转化而来，是临床上较常见、致残性高且难治的慢性头痛疾病。由于其发病机制尚不明确，目前临床上的治疗方法缺乏针对性，存在疗效不满意、病人不耐受和成瘾性等问题[1]。故针对其发病机制的进一步研究，有助于探寻新的预防和治疗方法。

目前许多研究表明中枢敏化增加了偏头痛发作的频率，促使发作性偏头痛转化为慢性偏头痛，其外在征象为病人头面部或其以外的皮肤，如上肢或者躯干，出现皮肤异常性疼痛，即痛觉过敏[2,3]。偏头痛中枢敏化主要由于痛觉通路中三叉神经脊束尾核部位 (trigeminal nucleus caudalis, TNC) 神经元信号调控异常引起，因此之前的研究多集中在神经元上，但是临床实践表明，针对神经元机制的药物治疗效果却并不理想[1]。近年来的研究发现，小胶质细胞分泌的炎性因子参与多种慢性疼痛模型中枢敏化的过程。在偏头痛的临床和基础研究中也发现存在异常的小胶质细胞激活[4]，但具体的作用机制不明，推测可能通过调节炎症信号通路来调控其中枢敏化的过程。NLRP3 (nod-like receptor protein 3)炎性小体 (inflammasome) 是由NLRP3、凋亡相关的斑点样蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 组成的多蛋白复合物，在中枢神经系统中主要表达在小胶质细胞上，是开启炎症过程的重要启动点[5]。NLRP3炎性小体已被证实与中枢神经系统多种炎症疾病有关，如抑郁、自发性脑出血、多发性硬化[6～8]，但其在慢性偏头痛中的作用尚未见报道。

因此，本研究参照Pradhan 报道的方法建立小鼠慢性偏头痛模型[9]，在国内外首次观察NLRP3炎性小体在中枢疼痛通路TNC 部位的表达及变化趋势，并观察干预NLRP3 炎性小体后，对慢性偏头痛小鼠眶周、足底的皮肤机械痛阈和神经元活化标志蛋白磷酸化细胞外信号调节激酶 (phospho-extracellular signal-regulated kinase, p-ERK)的影响[10]，探讨其在慢性偏头痛中的作用。明确这些问题可以为慢性偏头痛的病理生理机制和针对性的治疗提供新的思路。

方 法

1. 实验材料

（1）实验动物及分组：SPF 级雄性C57BL6/J 小鼠56 只（体重20～25 g），由重庆医科大学实验动物中心（实验动物生产许可证号：SYXK（渝）2012-0001）提供，在重庆医科大学附属第一医院动物实验室（使用许可证号：SYXK（渝）2010-002）分笼饲养。实验室内温度22±2 ℃，湿度50±5%，为12 h 昼夜明暗交替控光环境。所有实验的C57BL6/J 小鼠自由摄食饮水，适应性喂养1周后进入实验。实验过程均遵守国际疼痛研究联合会相关指南。实验C57BL6/J 小鼠使用随机数字表随机分为5 组：生理盐水对照组(n= 16)，模型组(n= 16)，模型+溶剂组(n= 8)，模型 + NLRP3 抑制剂5 mg/kg 组(n= 8)，模型 + NLRP3 抑制剂10 mg/kg组(n= 8)。

（2）实验试剂：注射用硝酸甘油 (nitroglycerin, NTG) 购于重庆医科大学附属第一医院（批号：国药准字H11020289）；NLRP3 兔多克隆抗体 (Biorbyt, UK)；p-ERK 小鼠单克隆抗体 (Cell Signaling, USA)；GAPDH 抗体（沈阳万类生物），HRP 标记的羊抗兔、羊抗小鼠IgG 抗体（北京中杉金桥），Iba-1 山羊多克隆抗体 (Abcam, UK)；Cy3 标记的驴抗山羊 (Proteintech, China)、488 标记的山羊抗兔 (Beyotime, China) IgG 抗体；DAPI (Beyotime, China)；BCA 蛋白浓度检测试剂盒 (Beyotime, China)、ECL 化学发光显影液 (Beyotime, China)。

2. 实验方法

（1）慢性偏头痛小鼠模型的建立：参照Pradhan等的报道[9]：通过反复腹腔注射NTG 建立慢性偏头痛模型。小鼠充分适应环境并随机分组后，模型组在1、3、5、7、9 天各注射1 次NTG，造模时间为9 天，共给药5 次，每只每次给药剂量为10 mg/kg，用0.9%生理盐水稀释为2 ml 溶液。生理盐水对照组在相同时间点注射等体积的0.9%氯化钠注射液。

（2）腹腔给予干预药物：本实验使用的NLRP3抑制剂MCC950 在既往文献中证实对NLRP3 有明确的抑制作用，且腹腔注射可以通过血脑屏障作用于中枢[11]。模型 + NLRP3 抑制剂组小鼠在完成造模后，再经腹腔注射溶于PBS 的MCC950（5 mg/kg 或10 mg/kg）。模型+溶剂组在相同时间点注射等量磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline, PBS)。

（3）机械痛阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)的测定：参照本课题组之前报道的方法[12,13]。将实验小鼠放置于22 cm×22 cm×30 cm 的透明铁丝网底笼子中适应30 min，并在安静状态下，用电子vonFrey 痛阈仪 (WoodLand Hills, CA, USA)测定小鼠眶周和足底的机械痛阈值。用痛阈仪纤维丝垂直轻触小鼠眶周和后爪的皮肤，小鼠出现快速缩回头部、发出叫声、抓脸或拔开纤维丝；后爪出现退缩或逃离视为阳性反应，仪器自动记录使小鼠产生阳性反射的最小刺激强度，取3 次测量的平均值作为机械痛阈值。在每次给予NTG 前测定其基础机械痛阈值，并给予NLRP3 抑制剂24 h 后，再次测定各组机械痛阈值的变化。

（4）蛋白提取与蛋白水平检测：最后一次药物干预后机械痛阈测定完成后，10%水合氯醛麻醉小鼠，取脑干TNC 组织，加入含有PMSF (Beyotime, China) 的RIPA 缓冲液 (Beyotime, China)，超声匀浆后置于4℃冰箱1 h，使其充分裂解，然后将组织液放入低温离心机离心 (4℃, 12 000 rpm, 15 min)，取上清，BCA 法测蛋白浓度。取40 μg/孔蛋白样品上样，10% SDS-PAGE 胶 (Beyotime, China) 电泳分离后，电转(250 mA)至PDVF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。分别加入相应一抗anti-NLRP3 (1:1000)、anti-p-ERK (1:2000) 4℃孵育过夜。第2 日复温2 h，TBST 漂洗3 次，每次10 min。加入相应二抗(1:5000) 37℃孵育2 h。TBST 漂洗3 次，每次10 min。采用 ECL (Beyotime, China) 试剂盒和凝胶成像系统 (Fusion, Germany)发光成像。使用Fusion 软件分析灰度值结果。

（5）免疫荧光双标检测：麻醉小鼠后，分别用生理盐水和4%多聚甲醛经心灌注，分离脑组织后放入4%多聚甲醛固定24 h，然后依次用20%和30%的蔗糖溶液充分脱水。使用冰冻切片机切取处理好的脑组织，切取10 μm 厚的组织片，切好后放入-80℃冰箱保存。实验时取出切片自然风干，PBS洗片后用0.3% Triton 破膜，37℃孵育10 min，PBS漂洗后使用山羊血清封闭，在37℃孵育30 min，然后去掉血清滴加一抗混合液：兔抗小鼠NLRP3 (1:100)、山羊抗小鼠Iba-1 (1:400)，4℃封闭过夜。次日PBS 充分漂洗后滴加包括Cy3 标记的驴抗山羊(1:80)、488 标记的山羊抗兔(1:80)的二抗混合液，于37%孵育1.5 h，再次用PBS 洗片，加DAPI 后37%孵育10 min，最后PBS 洗片并用50%的甘油封片，使用共聚焦显微镜检测。

3.统计学分析

结 果

1. 反复NTG 刺激可诱导小鼠痛觉过敏及TNC部位p-ERK 表达上调

使用vonFrey 痛阈仪测定小鼠基础痛阈值，与处理前第1天眶周和足底基础痛阈值(0.57±0.09 g、1.56±0.17 g)比较，反复腹腔注射生理盐水5 次的对照组小鼠基础痛阈值(0.56±0.09 g、1.52±0.10 g)无明显统计学差异；而反复腹腔注射完5 次NTG 的模型组小鼠的眶周和足底的基础痛阈值(0.12±0.03 g、0.25±0.09 g) 与处理前第1 天的基础痛阈值(0.56±0.07 g、1.48±0.10 g)相比，显著下降（P＜ 0.05，见图1）。Western blot 结果显示：腹腔隔日重复注射NTG 5 次的CM 模型组小鼠 TNC 部位p-ERK 的蛋白表达较生理盐水对照组显著增高（P＜ 0.05，见图3）。

2. 反复NTG 刺激可诱导小鼠TNC 部位NLRP3炎性小体表达上调

通过Western blot 实验检测两组小鼠TNC 部位NLRP3 蛋白表达水平，结果显示，腹腔隔日重复注射NTG 5 次后的CM 组TNC 部位的NLRP3 蛋白表达量较生理盐水对照组显著增加，差异具有统计学意义（P＜ 0.05，见图2）。

3. NLRP3 炎性小体抑制剂MCC950 对小鼠痛觉过敏及TNC 部位p-ERK 表达的影响

在隔日重复注射5 次NTG 后，与生理盐水对照组的小鼠眶周及足底机械痛阈值(0.58±0.13 g、 1.49±0.11 g)相比，CM 组的眶周及足底机械痛阈值(0.15±0.03 g、0.20±0.12 g)明显降低(P＜ 0.05)。而CM 组与CM + PBS 组小鼠眶周及足底机械痛阈值(0.16±0.04 g、0.21±0.07 g)并无统计学差异，说明溶剂对小鼠机械痛阈值无显著影响。腹腔注射给予NLRP3 抑制剂MCC950 (5 mg/kg、10 mg/kg)后，小鼠眶周(0.39±0.04 g、0.40±0.07 g)及足底(1.06±0.23 g、0.93±0.34 g)机械痛阈值相比CM + PBS 组均显著升高，且这两种剂量组中差异未见统计学意义（见图3）。Western blot 检测显示，与CM + PBS 组相比，给予NLRP3 抑制剂MCC950(5 mg/kg、10 mg/kg)后，p-ERK 的蛋白表达显著降低（P＜ 0.05，见图4）。

4. 免疫荧光检测结果。

使用免疫荧光检测NLRP3 在TNC 部位表达与定位情况，结果显示，NLRP3 炎性小体与小胶质细胞的标记物Iba-1 在TNC 存在共定位（见图5）。

讨 论

本研究参照Pradhan 等[9]的方法，通过反复腹腔注射已知的人类偏头痛诱因NTG 建立慢性偏头痛模型。该模型已经被多种偏头痛相关治疗药物进行了验证，普遍认为是研究CM 及偏头痛进展的可靠动物模型[14]。本课题组之前的研究[13]及本研究同样显示，连续NTG 给药可以引起实验小鼠基础痛阈的显著下降，提示痛觉过敏的产生，这和临床上观察到的CM 病人在头痛发作期或发作间期出现皮肤异常性疼痛的现象一致[2]。说明该模型模拟了慢性偏头痛的行为学状态。

目前的理论认为，慢性偏头痛可能是由于偏头痛反复发作引起中枢疼痛通路的慢性敏化所致[2]。在中枢神经系统中，小胶质细胞可通过其释放的促炎细胞因子直接或间接地影响神经元的兴奋性，参与慢性疼痛的启动和维持。而NLRP3 炎性小体是小胶质细胞的炎性级联反应中最重要的促炎因子生成途径，其激活后可活化caspas-1 水解pro-IL-1β，促进IL-1β 的成熟和分泌[5]。近年来，NLRP3 与疼痛的关系逐渐得到证实。在紫杉醇诱导的疼痛动物模型中，发现NLRP3 炎性小体参与外周致敏过程[15]。另一项研究表明，通过抑制脊髓背角小胶质细胞中的NLRP3 炎症小体活化，吗啡诱导的慢性疼痛得到缓解[16]。然而，很少有研究探索它与偏头痛的关系。目前仅有一项研究表明NLRP3 炎性小体在硬脑膜刺激的偏头痛模型的三叉神经节中表达增加[17]。值得注意的是，NLRP3 激活的条件通常是偏头痛产生的基础，例如细胞外K+离子浓度增高，过氧亚硝酸盐增加，线粒体功能障碍和活性氧 (ROS) 的产生[18,19]。但具体何种危险信号在慢性偏头痛中诱导NLRP3 激活还需进一步的研究。本研究发现，在反复腹腔注射NTG 的模型中，随着给药次数的增加，模型组小鼠眶周和足底的基础机械痛阈明显降低，而TNC 部位的NLRP3 蛋白表达量较对照组明显增加，免疫荧光显示NLRP3 在TNC 表达于小胶质细胞，提示NLRP3 炎性小体可能参与慢性偏头痛的病理生理机制。MCC950 是NLRP3 炎性小体的特异性小分子抑制剂，口服和静脉给药均能有效穿过血脑屏障作用于中枢神经系统。本研究结果表明，腹腔注射NLRP3 炎性小体抑制剂MCC950 后，模型组小鼠眶周和足底的基础机械痛阈显著升高，表明在形成偏头痛的慢性化后，阻断NLRP3 炎性小体可以抑制已经存在的痛觉过敏。

ERK 是MAPK 家族的一员，由上游MAPK/ERK 激酶激活。既往研究发现ERK 信号通路在外周敏化和中枢敏化中起重要作用，抑制ERK 的激活可减轻炎症或神经性疼痛[10]。目前的研究发现在辣椒素刺激硬脑膜模型中可诱导三叉神经节或TNC部位磷酸化ERK (p-ERK) 的表达[20]。因此，p-ERK作为神经元活化和中枢敏化的标志物也被应用于偏头痛的研究中。本研究发现，模型组小鼠TNC 部位的p-ERK 蛋白表达量较对照组明显增加，提示反复注射NTG 可以诱导TNC 部位的神经元活化。而给予NLRP3 炎性小体抑制剂MCC950 可以抑制p-ERK 蛋白表达的上调，表明NLRP3 炎性小体的变化可以影响神经元活化状态。

综上所述，在反复腹腔注射NTG 诱导的慢性偏头痛小鼠模型中，TNC 部位小胶质细胞NLRP3炎性小体表达显著增加，同时p-ERK 的表达也显著增加；NLRP3 炎性小体抑制剂MCC950 显著抑制小鼠的痛觉过敏表现及p-ERK 的表达。提示小鼠TNC 小胶质细胞上的NLRP3 炎性小体表达上调，可能通过影响小胶质细胞-神经元细胞信号交互通路，参与了慢性偏头痛的病理生理机制，其具体机制需进一步研究。