周艺琳,王正磊,许媛媛,韩先干,Vanhnaseng PHOUTHAPANE,苗晋锋*

(1.南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095;2.中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;3.老挝科技部生态与生物技术研究所,万象 01000)

白藜芦醇(resveratrol,Res)又称芪三酚,是一种天然存在的多酚类化合物,广泛存在于多种植物和商业产品中,如葡萄、花生、虎杖及红酒等。它通常被认为是一种植物抗毒素,可应对紫外辐射、化学毒素、真菌与细菌感染等在内的多种有害刺激。研究表明,白藜芦醇具有多种生理功能,包括抗氧化、抗菌、保护心脏和抗肿瘤作用等[1]。

氧化应激(oxidative stress,OS)的实质是机体产生的生物活性物质超过了自身的抵抗能力,导致机体氧化与抗氧化系统动态失衡。当机体受到损伤、病原微生物感染等应激时,会产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)、活性氮(reactive nitrogen species,RNS)等自由基,这些物质在杀灭病原的同时会损伤细胞和组织。机体在进化过程中不断完善自身的抗氧化防御系统,抵抗氧化应激的发生,其中核因子 E2 相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是机体内1个关键的核转录因子,在机体抵抗氧化应激过程中发挥关键作用。当机体发生氧化应激时,Nrf2活化入核并诱导其靶基因表达,如血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]、谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferase,GST)等的基因表达,清除自由基,缓解氧化应激[2]。

本课题组前期研究表明,乳房链球菌(Streptococcusuberis)、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌感染均可显著提高乳腺上皮细胞中ROS、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及上清中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量或活性,降低总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC),引起氧化损伤[3-4]。白藜芦醇作为一种有效的抗氧化剂,能否缓解S.uberis感染引起的氧化损伤,这种作用是否与Nrf2通路有关,为此,本试验以小鼠乳腺上皮细胞与乳房链球菌为材料,对抗氧化水平及Nrf2通路中关键指标进行检测,以期阐明白藜芦醇缓解乳房链球菌感染引起氧化应激的机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)与乳房链球菌(S.uberis0140J)均购自美国模式培养物集存库(ATCC);DMEM培养液、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)、胎牛血清均购自Gibco公司;白藜芦醇购于生工生物工程(上海)股份有限公司;ROS荧光探针、BCA试剂盒、RIPA缓冲液、蛋白上样缓冲液购于南京碧云天生物公司;GAPDH抗体购于南京巴傲得生物科技有限公司;Nrf2抗体及二抗购于CST公司;LDH、T-AOC、SOD、MDA检测试剂盒和PMSF购于北京索莱宝科技有限公司;NAGase、NO、iNOS检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所;相关引物于擎科生物科技有限公司合成;PrimeScript RT Master Mix、TB GreenTMPremixExTaq酶购自TaKaRa公司;全波长酶标仪购于Thermo Fisher公司;C6个人型流式细胞仪购于BD公司;Tanon-3900成像系统购于上海天能科技有限公司;倒置显微镜购于Nikon公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌培养将S.uberis按1∶100(体积比)的比例接种于灭菌的Todd-Hewitt Broth(THB)培养基中,在37 ℃,180 r·min-1的恒温培养箱中培养至对数生长期(D600=0.45～0.55)。

1.2.2 细胞培养及处理小鼠乳腺上皮细胞系EpH4-Ev培养在细胞专用培养瓶中,用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养液在37 ℃、5% CO2的条件下培养,备用。将EpH4-Ev细胞传代至6孔板中培养,待其生长至80% 融合时,更换为无血清DMEM培养基,饥饿处理4 h,试验组加入15 μmol·L-1白藜芦醇培养4 h,然后按复合感染数(MOI)为10接入乳房链球菌,轻轻混匀,共孵育3 h;对照组适时加入等量PBS,收集处理后的细胞样品液,进行如下测定。

1.2.3 RT-PCR检测取处理后细胞,弃上清液,用PBS洗3次,根据说明书提取细胞内的总RNA,将其反转录成cDNA,之后进行荧光定量PCR,检测HO-1、NQO1、CAT、GST基因mRNA的表达。相关引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列及扩增片段大小Table 1 Primer sequences and its products size designed for RT-qPCR

1.2.4 蛋白提取及电泳取处理后细胞,弃上清液,PBS洗3次,加入适量裂解液,用刮刀刮取细胞,收集至1.5 mL离心管中,4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min。取上清液采用BCA法检测并调节蛋白浓度,然后加入相应体积的上样缓冲液,混匀后100 ℃水浴中煮10 min,置于冰上冷却,-80 ℃冰箱保存。

将预染蛋白标准品和样品上样至SDS-PAGE胶孔里,80 V电泳至浓缩胶与分离胶分界线,然后调节电压至120 V,电泳至凝胶下部,停止电泳;100 V湿转印90 min,50 g·L-1牛血清白蛋白室温封闭2 h后加入一抗4 ℃过夜孵育;TBST清洗,加入1∶10 000稀释的二抗室温孵育2 h,弃二抗,TBST清洗。放入发光成像系统,加发光液拍照并用Image J软件统计分析。

1.2.5 流式细胞术检测取处理后细胞,弃上清液,PBS洗3次后,加入终浓度为10 μmol·L-1的DCFH-DA(2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐),37 ℃恒温培养箱中孵育20 min,弃上清液后PBS洗3次,加入胰酶消化,收集于流式管中进行流式细胞术检测。

1.2.6 显微镜下观察取处理后细胞,弃上清液,PBS洗3次,加1 mL PBS于6孔板中,在显微镜下观察并拍照。

1.2.7 生化指标测定细胞完成处理后,收集上清液于2 mL离心管中,4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min后,收集上清液于另一干净2 mL离心管中,按说明书分别检测LDH、NAGase活性及NO含量。取贴壁的细胞用PBS洗3次后,按说明书加入相应的提取液,刮取细胞至1.5 mL离心管,超声波破碎细胞后,离心取上清液,按说明书分别检测iNOS和SOD活性及T-AOC水平、MDA含量。

1.3 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇预处理对乳房链球菌感染乳腺上皮细胞内ROS水平、NO含量及iNOS活性的影响

结果如图1所示:与未处理对照组相比,单加白藜芦醇均显著降低乳腺细胞中ROS水平、NO含量及iNOS活性,而S.uberis感染与之相反。与S.uberis感染组相比,白藜芦醇预处理显著降低ROS水平、NO含量及iNOS活性。说明乳房链球菌感染引起细胞产生氧化应激,白藜芦醇对其有干预作用。

2.2 乳房链球菌感染及白藜芦醇预处理对乳腺上皮细胞损伤和抗氧化水平的影响

如图2所示:与未处理对照组相比,单加白藜芦醇显著降低NAGase活性,MDA含量有下降的趋势,显著提高SOD活性和T-AOC水平;而S.uberis感染组LDH、NAGase、SOD活性及MDA含量显著增加,T-AOC水平显著下降。与感染组相比,白藜芦醇预处理显著降低LDH、NAGase活性和MDA含量,提高SOD活性与T-AOC水平。上述结果进一步说明S.uberis感染使机体抗氧化能力降低,引起氧化损伤,而白藜芦醇预处理可以提高机体的抗氧化能力,缓解由S.uberis感染引起的氧化损伤。

2.3 白藜芦醇预处理对乳房链球菌感染乳腺上皮细胞形态的影响

如图3所示:正常情况下,EpH4-Ev乳腺上皮细胞均边界清晰,呈典型的多边形特征(图3-A、B、C)。S.uberis感染使细胞出现变圆、皱缩等形态变化(图3-D),白藜芦醇预处理可以显著改善这些变化(图3-E)。表明白藜芦醇可以缓解乳房链球菌感染造成的细胞损伤。

2.4 白藜芦醇预处理对乳房链球菌感染乳腺上皮细胞中Nrf2蛋白表达的影响

如图4所示:与正常组相比,单加白藜芦醇或S.uberis感染均可以显著提高乳腺上皮细胞中Nrf2蛋白水平。当S.uberis感染时,白藜芦醇预处理提高了Nrf2蛋白的表达。说明S.uberis感染对Nrf2蛋白有一定的激活作用,而白藜芦醇预处理可以使之进一步激活。

2.5 白藜芦醇预处理对乳房链球菌感染乳腺上皮细胞Nrf2下游靶基因表达的影响

如图5所示:与对照相比,白藜芦醇单独处理或S.uberis感染均可显著提高Nrf2靶基因HO-1、NQO1、CAT和GST的mRNA水平。当S.uberis感染时,白藜芦醇预处理提高Nrf2靶基因的mRNA水平。说明S.uberis感染可以在一定程度上刺激Nrf2下游靶基因的表达,而白藜芦醇预处理可以进一步激活机体的抗氧化防御系统。

3 讨论

S.uberis是一种重要的环境性致病菌,感染机制比较复杂,可黏附、内化到乳腺上皮细胞内,造成胞内感染[5]。本课题组Li等[4]和王正磊等[6]已证明S.uberis感染会显著提高小鼠乳腺上皮细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6水平,提高NAGase和LDH活性,造成炎症损伤,而利用抗氧化物质可以有效干预S.uberis感染造成的炎症反应并且缓解细胞损伤。近年来,白藜芦醇由于具有强大的抗氧化能力而引起学者的关注。研究发现,在类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞中,白藜芦醇可以缓解过氧化氢诱导的氧化应激和凋亡[7];白藜芦醇可以保护奶牛乳腺上皮细胞抵御过氧化氢诱导的氧化损伤[8];在链脲佐菌素诱导的大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型中,白藜芦醇对其引起的炎症反应和氧化应激具有保护作用[9]。在本研究中,我们将S.uberis与EpH4-Ev细胞共培养后,检测培养上清液中LDH和NAGase活性,发现白藜芦醇预处理可以显著降低两者的活性,缓解S.uberis感染造成小鼠乳腺上皮细胞的损伤。正常情况下LDH和NAGase均位于细胞内,当细胞受到损伤或崩裂时,它们会释放至胞外,因此常作为衡量细胞损伤严重程度的重要指标[10-11]。

ROS、RNS等多种活性物质的大量产生会造成细胞损伤,同时它们也是衡量机体氧化应激严重程度的重要指标[12]。其中RNS的合成需要以NO作为前体小分子,NO主要由iNOS催化形成。本研究结果显示,S.uberis感染显著提高ROS水平、NO含量及iNOS活性,而白藜芦醇预处理显著降低这些变化,说明白藜芦醇可以显著缓解S.uberis感染诱发的氧化应激,推测白藜芦醇可能通过发挥抗氧化作用缓解炎症。细胞由于自身代谢也会产生少量自由基,白藜芦醇作为一种多酚化合物可将其清除,因此在正常情况下白藜芦醇同样具有一定的抗氧化作用[13]。推测白藜芦醇抗氧化性能与其3、4、5位3个羟基的酚环、共轭双键的存在以及结构分子中电子离域有关[14]。

一些生化指标常用于衡量机体的抗氧化状况,其中T-AOC是机体抗氧化防御系统的综合评价指标,能衡量机体对自由基清除能力,MDA 是脂质过氧化产物,代表细胞中脂质过氧化水平[15-16]。本研究结果发现,S.uberis感染后,细胞内T-AOC水平显著降低,MDA含量显著升高,而白藜芦醇可以显著改善这些变化。这可能是S.uberis感染导致细胞产生大量的ROS、RNS,使T-AOC水平降低,引发脂质过氧化,造成MDA含量升高。此外机体内还存在一些抗氧化酶,如SOD是一种清除自由基的金属酶,它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢,被称为人体天然的垃圾清道夫[17-18]。本试验结果显示S.uberis感染后,细胞内SOD升高,白藜芦醇进一步使之升高。而SOD是Keap1-Nrf2通路下游主要的抗氧化蛋白[18-19],推测白藜芦醇发挥抗氧化作用与此通路相关。

Keap1-Nrf2通路在机体抗氧化过程中发挥重要作用。Nrf2是一种核转录因子,氧化应激发生时与其偶联的抑制因子Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)会发生变构,Nrf2与之分离并活化入核,启动SOD、HO-1、CAT等一系列抗氧化酶的表达。本研究结果显示,S.uberis感染显著提高Nrf2蛋白水平并促进调控区SOD的表达,以及HO-1、NQO1等基因转录,说明S.uberis感染可以在一定程度上活化Nrf2通路,机体以此主动抵御部分感染。然而机体对自由基的清除能力有限,当超过承受范围即引起氧化应激。用白藜芦醇处理能进一步激活Nrf2及其介导的抗氧化系统,提高机体对自由基的清除能力,从而缓解S.uberis感染引起的氧化损伤。本研究结果与相关报道相似,例如,海藻糖通过调节Keap1-Nrf2途径缓解百草枯诱导的小鼠肝癌细胞的氧化应激[20];脱氢表雄酮通过激活Nrf2/ARE信号通路减轻铁性癫痫的氧化应激和凋亡[21]。Zhou等[22]研究发现,在奶牛乳腺上皮细胞中,白藜芦醇可以通过活化Nrf2通路缓解黄曲霉毒素b1诱导的氧化应激和细胞凋亡。本研究使用的是细胞模型,接下来需要体内试验进一步验证。

综上所述,S.uberis感染会引起机体氧化应激的发生,白藜芦醇预处理可缓解S.uberis感染引起的氧化损伤。其原因有二,一是白藜芦醇直接清除自由基,二是白藜芦醇激活Nrf2及其介导的抗氧化系统缓解氧化损伤。本研究为白藜芦醇作为营养元素缓解氧化应激提供了一定的理论支持。