张杰 陈冲 张倩玉

[摘要]本文以双低菜籽饼粕为原料，选择碱溶酸沉法、Osborne分级提取法和膜分离法三种蛋白制备方法分别分离提取菜籽蛋白，通過测定和分析蛋白样品的功能性质等，对三种菜籽蛋白制备方法进行比较。结果表明，与碱溶酸沉法和Osborne分级提取法相比，膜分离法蛋白回收率最高，达到40%，膜分离法获得了2S清蛋白组分和12S球蛋白组分，含量分别为84.5%和85.3%。膜分离法制备的蛋白样品功能性质最佳，其中球蛋白组分溶解度83.1%、起泡性56%、泡沫稳定性71.4%、乳化性61.7%、乳化稳定性89.7%;清蛋白组分溶解度97.9%、起泡性68%、泡沫稳定性35.3%、乳化性58.7%、乳化稳定性92.6%。

[关键词]菜籽蛋白;碱溶酸沉法;Osborne分级提取法;膜分离法

中图分类号：TS201.21 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202005

油菜籽作为油料作物具有重要地位，菜籽榨油后的副产物为菜籽饼粕，其中含有35%～45%的蛋白质[1]，菜籽蛋白质中80%以上为贮藏蛋白，其余为膜蛋白，贮藏蛋白包括12S球蛋白（cruciferin）、2S清蛋白（napin），以及一些较小的蛋白质如胰岛素抑制剂和脂质转移蛋白。12S球蛋白天然构象的平均分子量在300kDa左右，在极端pH条件下可分裂成6个亚基，每个亚基都由α和β两条分子量为大小在20～30kDa的多肽链组成，约占菜籽蛋白的60%，等电点约7.2;2S清蛋白是一种碱性蛋白，约占菜籽蛋白的20%，相对分子量约12～17kDa，等电点约11[2]。菜籽蛋白具有很高的营养价值，是一种全价蛋白、无限制性氨基酸，且氨基酸组成合理，尤其是含有丰富的碱性氨基酸（赖氨酸）和含硫氨基酸（甲硫氨酸、半胱氨酸），符合FAO与WHO的推荐模式，总体品质优于大豆蛋白，媲美酪蛋白[3]。所以，菜籽饼粕是一种巨大的优质植物蛋白来源，目前菜籽饼粕主要用于动物饲料方面，对菜籽饼粕中优质蛋白的利用仍然不足。

目前在菜籽蛋白的提取制备方面，还是以碱溶酸沉法为主，该法虽然工艺简单、成本较低，但是蛋白回收率较低，制备的蛋白质功能性质较差，制约了菜籽蛋白的商业化发展。此外，菜籽蛋白以12S球蛋白和2S球蛋白为主，碱溶酸沉法仅能获取菜籽分离蛋白，若能将菜籽蛋白中的球蛋白和清蛋白分离制备，做到产品的细分，并依据其特性有针对性地进一步加工利用，将极大地提升菜籽蛋白的利用度。

本研究以双低菜籽粕为原料，选择碱溶酸沉法、Osborne分级提取法和膜分离法三种蛋白提取方法制备菜籽蛋白，从蛋白样品的蛋白含量、溶解度和回收率等方面比较三种方法的优缺点，优选出适合工业化生产制备优质菜籽蛋白的技术方法。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

双低菜籽粕：市售，粉碎过80目，于4℃环境储存;30kDa超滤膜：德国默克公司;正己烷、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、Tris、硼酸、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸：分析纯，费希尔控制设备国际有限公司。

1.2 仪器与设备

IKA磁力搅拌器：德国IKA仪器设备有限公司;GL-21M离心机：上海市离心机械研究所有公司;FreeZone12Plus冻干机：美国LABCONCO公司;KX-100型高速多功能粉碎机、DHG-9140A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司;BUCHIK-436快速消解仪、BUCHIK-360自动滴定仪：瑞士BUCHI公司;MERCK400mL超滤杯：德国默克公司。

2 实验方法

2.1 双低菜籽粕的脱脂

参考李杨[4]的方法，使用正己烷和索氏抽提器对双低菜籽粕进行脱脂处理。

2.2 菜籽蛋白的制备

2.2.1 碱溶酸沉提取菜籽蛋白

根据雷丽云[5]的方法采用碱溶酸沉法提取菜籽蛋白。将菜籽粕溶于蒸馏水（质量体积比1∶10）中，用1mol/L的NaOH溶液调节pH至11.0，室温搅拌2h，4℃、10 000r/min下离心20min。收集上清液，用1mol/L的HCl溶液调节pH至4.5，静置2h，4℃、10 000r/min下离心20min，弃去上清液，沉淀物4℃下透析，冷冻干燥得到菜籽分离蛋白。

2.2.2 Osborne分级提取法

参照瞿瑗等[6]描述的Osborne分级方法，将菜籽粕溶于蒸馏水（质量体积比1∶10）中，室温搅拌2h，4℃、10 000r/min下离心20min。收集上清液冷冻干燥得到2S清蛋白组分，收集沉淀，向沉淀中加入3%的氯化钠溶液（质量体积比1∶10），室温搅拌2h，4℃、10 000r/min下离心20min。收集上清液，4℃下透析，冷冻干燥得到12S球蛋白组分。

2.2.3 膜分离法

参考黄橙子[7]的方法，将菜籽粕溶于0.1mol/L的Tris-HCl溶液（质量体积比1∶10）中，室温搅拌2h，4℃、10 000r/min下离心20min。收集上清液，选用30kDa的超滤膜进行超滤，截留液为大于30kD的组分，滤出液为小于30kD的组分，将截留液和滤出液分别进行透析除盐和冷冻干燥，截留液部分得到的样品为12S球蛋白组分，滤出液部分得到的样品为2S清蛋白组分。

2.3 菜籽蛋白含量的测定

参照《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》（GB/T 6432—2018）[8]测定菜籽蛋白的含量。

2.4 菜籽蛋白溶解度的测定

参照戴彩霞等[9]的方法，测定蛋白的溶解度。将不同蛋白样品制备成蛋白溶液，调节pH至所需条件，搅拌30min使样品混匀，静置2min后，将上层液倒入离心管中离心（5 000r/min，20min）。取上清液，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。溶解度计算公式如下：

2.5 菜籽蛋白起泡性及起泡稳定性的测定

参照李天文[10]的方法，测定蛋白质的起泡性及泡沫稳定性。称取1g菜籽蛋白样品，分散于蒸馏水（料液比1∶100）中，10 000r/min下均质60s。均质结束后快速将溶液倒入量筒中，记录均质停止时的泡沫体积，用V0表示，起泡性按下列公式计算：

将量筒在室温条件下放置30min，记录均质停止30min后的泡沫体积，用V表示，泡沫稳定性按下列公式计算：

2.6 菜籽蛋白乳化性及乳化稳定性的测定

准确称取2份均为0.1g的菜籽蛋白样品，加入2.5mL蒸馏水，充分溶解样品，再加入2.5mL大豆油，快速涡旋震荡5min后，吸取两管中液体部分，将其移入10mL离心管中。1 000r/min条件下离心3min后稳稳取出离心管，记录此时离心管中乳化层高度H1和液体高度H2，乳化性按下列公式计算：

将离心后的离心管放入80℃的恒温水浴锅中，加热20min后移出，用自来水快速冷却至室温，在1 000r/min条件下离心3min，缓缓取出离心管，记录此时离心管中乳化层高度H3和液体高度H4，乳化稳定性按下列公式计算：

2.7 菜籽蛋白回收率的测定

参考任娇艳等[11]的方法测定蛋白回收率。考察三种提取方式对菜籽蛋白回收率的影响，取一定量的菜籽粕制备菜籽蛋白样品，蛋白回收率计算公式如下：

2.8 菜籽蛋白分子量分布的测定

参照高瑀珑等[12]的方法，采用电泳仪进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，具体方法如下：将菜籽蛋白样品配制成约5mg/mL的蛋白溶液，与样品缓冲液按一定稀释比混合，沸水浴5min左右，加10μL样品于电泳凝胶内，电压100V，时间2h，待蛋白条带移至底端后取出电泳凝胶，在考马斯R-250溶液中染色1h左右。染色结束后，将电泳凝胶移至脱色液中过夜脱色，中途更换一次脱色液，待胶片中条带清晰后拍照分析。

2.9 试验数据的统计与分析

使用SPSS软件对数据进行处理分析，数据采用单因素方差分析（ANOVA）和邓肯多变量检验，差异有统计学意义（P<0.05），使用Oringin 2018软件作图。

3 结果与讨论

3.1 菜籽蛋白含量的比较

将碱溶酸沉法制备的菜籽分离蛋白记为RPI，将Osborne分级提取法制备的球蛋白和清蛋白分别记为OC、ON，膜分离法制备的球蛋白和清蛋白分别记为MC、MN。结果如图1所示。

由图1可知，提取方式对蛋白含量具有显著影响。RPI蛋白含量达到81%、OC蛋白含量66.4%、ON蛋白含量为60.7%、MC蛋白含量为85.3%、MN蛋白含量为84.5%。Osborne分级提取法制备的蛋白样品蛋白含量较低的原因可能是Osborne分级提取法是根据2S清蛋白组分和12S球蛋白组分的溶解特性的不同进行分步提取，相关文献表明分级提取法制备的蛋白样品蛋白含量普遍较低。例如，李婷等[13]从花生中分级提取球蛋白和清蛋白，蛋白含量分别为73.2%和53.59%;田旭静等[14]从藜麦糠中分级提取清蛋白，蛋白含量43.21%。原因可能是简单的水相提取过程导致样品中含有较多可溶性杂质，所以Osborne分级提取法制备的菜籽蛋白在蛋白含量方面低于另外两种提取方法。

3.2 菜籽蛋白溶解度的比较

不同方法获得的菜籽蛋白溶解度结果如图2所示。

由图2可知，提取方式对样品溶解度有显著影响，RPI溶解度46.9%，OC溶解度79.7%、ON溶解度89.8%、MC溶解度83.1%、MN溶解度97.9%。膜分离法得到的菜籽蛋白（MN）溶解性显著优于碱溶酸沉法和Osborne分级提取法（P<0.05），原因可能是菜籽蛋白在强酸强碱条件下发生变性，结构变松散，暴露出更多的疏水基团，导致样品溶解度降低[15]。所以，碱溶酸沉法制备的蛋白样品溶解度明显低于另外两种方法制备的蛋白样品。

3.3 菜籽蛋白起泡性及泡沫稳定性的比较

不同方法获得的菜籽蛋白的起泡性及泡沫稳定性结果如图3所示。

由图3可知，提取方式对样品起泡性和泡沫稳定性有显著影响，RPI起泡性16%、泡沫稳定性75%，OC起泡性44%、泡沫稳定性45.5%，ON起泡性32%、泡沫稳定性50%，MC起泡性56%、泡沫稳定性71.4%，MN起泡性68%、泡沫稳定性35.3%。付本宁等[16]研究了影响花椒籽仁分离蛋白起泡性与泡沫稳定的因素，结果表明，决定蛋白溶解度的pH环境是影响蛋白起泡性的关键因素，在同样的pH环境下，膜分离法制备的蛋白样品有较好的溶解性和较高的蛋白含量，所以膜分离法制备的蛋白样品起泡性优于其他蛋白样品。

3.4 菜籽蛋白乳化性及乳化稳定性的比较

不同方法获得的菜籽蛋白的乳化性及乳化稳定性结果如图4所示。

由图4可知，著性差异（P<0.05）。蛋白乳化性是植物蛋白的基本特性之一，对饮料、乳制品等产品的品质稳定具有重要影响，影响蛋白乳化性的最主要因素是蛋白溶解度。王丽娜等[17]通过热改性增强了紫苏蛋白的乳化性。综合比较，膜分离法制备的蛋白样品在乳化性和乳化稳定性上优于碱溶沉法和Osborne分級提取法。

3.5 分子量分布情况

不同方法获得的菜籽蛋白质的分子量分布结果如图5所示。

由图5可知，1、2处为12S球蛋白条带;3、4处为2S清蛋白条带。RPI、ON、OC三个样品都出现了2S清蛋白和12S球蛋白的条带，说明碱溶酸沉法和分级提取法无法实现球蛋白和清蛋白的分离提取;MN样品只出现了2S清蛋白的条带，说明膜分离法可以分离提取出2S清蛋白;MC样品虽然出现了2S清蛋白和12S球蛋白的条带，但凝胶电泳使用的样品只进行了一次超滤，且由于超滤过程终点不确定，截留液中含有2S清蛋白的可能性较大，2S清蛋白没有完全被滤出。如果工业生产中进行多次超滤，理论上可以分离提取出较纯的12S球蛋白。通过比较可以得出，膜分离法在菜籽蛋白的分离制备上优于碱溶酸沉法和Osborne分级提取法。

3.6 蛋白回收率比较

如图6所示，提取方式对蛋白回收率有显著影响（P<0.05），其中碱溶酸沉法蛋白回收率约12.6%，分级提取法蛋白回收率约28%，膜分离法蛋白回收率最高，约40%。由于菜籽蛋白成分复杂，具有多个等电点区域，采用等电点沉淀法获取蛋白会造成蛋白得率较低;分级提取法采用水和稀盐溶液进行两步提取，有一定的蛋白得率;膜分离法调节了溶液pH值，增加了蛋白的溶出，提高了蛋白得率。所以，膜分离法蛋白回收率高于碱溶酸沉法和分级提取法。

4 结 论

本文以双低菜籽饼粕为原料，选择碱溶酸沉法、Osborne分级提取法和膜分离法三种蛋白制备方法分别分离提取菜籽蛋白，对蛋白样品功能性质等方面的测定分析对三种菜籽蛋白制备方法进行比较，具体结果如下。

（1）蛋白含量和回收率分析比较：碱溶酸沉法制备的蛋白含量为81%;膜分离法制备球蛋白和清蛋白含量分别为85.3%和84.5%;Osborne分级提取法制备的球蛋白和清蛋白含量分别为66.4%和66.7%。碱溶酸沉法蛋白回收率12.6%;Osborne分级提取法蛋白回收率为28%;膜分離法蛋白回收率为40%。膜分离法在蛋白含量和蛋白回收率方面均优于另外两种方法。

（2）菜籽蛋白的溶解度、起泡性、乳化性分析比较：碱溶酸沉法制备的菜籽蛋白溶解度46.9%、起泡性16%、乳化性53.2%;Osborne分级提取法制备的球蛋白和清蛋白溶解度分别为79.7%和89.8%、起泡性分别为44%和45.5%、乳化性分别为54.3%和56.5%;膜分离法制备的球蛋白和清蛋白溶解度分别为83.1%和97.9%、起泡性分别为56%和68%、乳化性分别为61.7%和58.7%。膜分离法制备的菜籽蛋白样品在功能性质方面优于另外两种方法制备的蛋白样品。

（3）菜籽蛋白的组分分析：碱溶酸沉法制备的是菜籽分离蛋白，同时含有球蛋白和清蛋白条带;分级提取法虽然按照球蛋白和清蛋白的溶解特性分别进行了分离提取，但是不能完全将12S组分和2S组分分离开来，两个组分均含有球蛋白和清蛋白条带;膜分离法获得了较纯的2S清蛋白组分，仅有清蛋白条带出现，但是因为超滤终点不确定，导致截留液中还含有2S清蛋白组分的残留，若进行进一步充分的超滤，理论上可以将2S组分和12S组分完全分离。

以上结果表明，膜分离法制备的菜籽蛋白样品蛋白含量和蛋白回收率最高，能做到菜籽蛋白的分离制备，并且表现出更好的功能性质。所以，从菜籽粕原料的利用度及菜籽蛋白产品质量角度考虑，膜分离法是一种适合工业化生产的、优质的菜籽蛋白制备方法。

参考文献

[1]易起达.酶解制备菜籽肽及其抗氧化作用研究[D].南京：南京财经大学，2013.

[2]何荣.菜籽蛋白源肾素和ACE双重抑制肽的制备及其抑制机制研究[D].无锡：江南大学，2013.

[3]戴彩霞，何荣.超高压和加热处理对菜籽蛋白功能性质和结构的影响研究[J].中国油脂，2019，44（7）：68-74.

[4]李扬.菜籽蛋白基纳米银抗菌复合膜的制备与研究[D].南京：南京财经大学，2018.

[5]雷丽云.双低菜籽饼粕蛋白的制备及其功能特性研究[D].镇江：江苏大学，2007.

[6]瞿瑗，余国贤，黎杉珊，等.Osborne法分级提取青花椒籽蛋白质及其理化性质研究[J].核农学报，2018，32（12）：2373-2379.

[7]黄橙子.酸溶性大豆蛋白的制备及其在酸性饮料中的应用[D].上海：华东师范大学，2013.

[8] GB/T 6432—2018，饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法[S].

[9]戴彩霞，何荣.超高压和加热处理对菜籽蛋白功能性质和结构的影响研究[J].中国油脂，2019，44（7）：68-74.

[10]李天文.麦胚蛋白的分级提取及其理化和功能特性研究[D].大庆：黑龙江八一农垦大学，2009.

[11]任娇艳，史传超，常博，等.核桃蛋白的分离制备及其酶解  物的抗氧化特性[J].现代食品科技，2019，35（3）：118-124.

[12]高瑀珑，郑锐，王玉梅，等.菜籽分离蛋白分子质量分布及酶解条件的研究[J].中国粮油学报，2014，29（6）：38-45.

[13]李婷，彭宇宁，李强，等.4种花生蛋白的分级提取及其结构的扫描电镜观察[J].食品科学技术学报，2015，33（3）：35-42.

[14]田旭静，段鹏慧，陈文超，等.Osborne分级法提取藜麦糠清蛋白及功能性质研究[J].食品工业科技，2017，38（12）：264-269+276.

[15]张英蕾，姚鑫淼，卢淑雯，等.碱溶酸沉法提取黑豆蛋白工艺优化[J].中国食品添加剂，2019，30（1）：60-68.

[16]付本宁，李超，潘姝璇，等.花椒籽仁分离蛋白起泡力及泡沫稳定性的影响因素研究[J].中国油脂，2018，43（9）：40-43+48.

[17]王丽娜，李凤林，康立宁.响应面法优化紫苏蛋白的乳化特性[J].吉林农业科技学院学报，2019，28（4）：1-5+115.