胡 伊 于泓鹏 吴克刚 刘晓丽

(广东工业大学轻工化工学院， 广东 广州 510000)

牡丹籽中含有7%～8%的油脂、9.9%的淀粉、20.35%的蛋白质和多种生物活性物质，尤其是不饱和脂肪酸含量较高[1]。2011年，国家卫生和计划生育委员会发布《关于批准元宝枫籽油和牡丹籽油作为新资源食品的公告》，将牡丹籽列为新资源食品[2]。牡丹籽粕是牡丹籽经压榨取油后的一种副产品，年产量达2.25万t[3]，但大部分都被废弃。牡丹籽粕不仅含有丰富的蛋白质、8种必需氨基酸、不饱和脂肪酸和亚麻酸[4]，还含有多糖、多酚、VE、植物甾醇、黄酮等抗氧化活性成分[5]，可开发成食品、药品等。牡丹籽粕中富有微生物生长代谢的碳源，可作为微生物培养基物的来源，生产相关发酵产品。宋王婷等[6]利用牡丹籽粕和白酒曲研制开发出一种具有特殊风味的牡丹籽酒。李杰[7]采用牡丹籽粕或辣木籽粕为主要原料制成一种具有抗氧化、降血压等功能的牡丹辣木酱油。利用牡丹籽粕酿造酱油，即以牡丹籽粕全替代大豆或豆粕，并辅以面粉和麸皮经制曲和发酵而成的一种新型液态调味品，不仅营养丰富，还具有典型的酱油风味和独特的香气及滋味。目前，相关的研究主要集中在酿造工艺条件的优化上，对其品质分析和功能性的研究尚未见报道。

试验拟以提取油脂后的牡丹籽粕为原料，优化其酱油发酵工艺，并研究牡丹籽粕酱油的抗氧化活性，旨在为提高牡丹籽粕的资源利用和精深化发展提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

牡丹籽粕大曲：牡丹籽粕与麦麸以8∶2的比例制得，自制；

酱油品牌S1、酱油品牌S2：市售；

氢氧化钠、甲醛、无水乙醇、浓硫酸、盐酸、冰乙酸、六水三氯化铁、硫酸亚铁、无水醋酸钠：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；

1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、2,2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

生化培养箱：LRH型，上海恒科学仪器有限公司；

pH计：PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S型，巩义市予华仪器有限责任公司；

恒温振荡器：SHA-BA型，常州澳华仪器有限公司；

酶标仪：FC型，美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验设计

(1) 发酵温度：准确称取300 g成曲分装于3个锥形瓶中，按料液比1∶1.5 (g/mL)加入11%盐水，恒温发酵20 d，考察发酵温度(30，35，40，45，50 ℃)对牡丹籽粕酱油氨基态氮和可溶性无盐固形物的影响。

(2) 发酵时间：称取300 g成曲分装于3个锥形瓶中，按料液比1∶1.5 (g/mL)加入11%盐水，45 ℃培养箱中恒温发酵，考察发酵时间(15，20，25，30，35 d)对牡丹籽粕酱油氨基态氮和可溶性无盐固形物的影响。

(3) 盐水浓度：称取300 g成曲分装于3个锥形瓶中，按料液比1∶1.5 (g/mL)加入盐水，45 ℃恒温发酵20 d，考察盐水浓度(7%，9%，11%，13%，15%)对牡丹籽粕酱油氨基态氮和可溶性无盐固形物的影响。

1.3.2 响应面试验设计 在单因素试验基础上，以发酵温度、发酵时间、盐水浓度为自变量，以氨基态氮含量为评价指标，根据Box-Benheken中心组合设计原理，设计三因素三水平响应面试验优化酱油发酵工艺条件。

1.3.3 灭菌工艺对牡丹籽粕酱油抗氧化能力的影响 取10 mL牡丹籽粕生酱油按表1进行灭菌，测定灭菌后酱油的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力及铁离子还原力，并与两种市售酱油进行比较。以生酱油为对照。

1.3 指标测定

1.3.1 氨基态氮 按GB 18186—2000执行。

表1 灭菌工艺

1.3.2 可溶性无盐固形物 按GB 18186—2000执行。

1.3.3 DPPH·清除能力 参照Brand-Williams等[8]的方法。用无水乙醇配制浓度为0.20 mmol/L的DPPH醇溶液和6.25 g/L的Trolox溶液。将酱油稀释10倍，取2 mL待测液加至2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中，混匀，室温避光反应60 min，测定517 nm处吸光度值。取2 mL一系列梯度的Trolox 标准溶液，加至2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中，混匀，室温避光反应60 min，测定517 nm处吸光度值。按式(1)计算DPPH·清除率。

(1)

式中：

SCR——DPPH·清除率，%；

Ac——对照溶液吸光度值；

As——样品溶液吸光度值；

Ab——空白吸光度值。

1.3.4 ABTS+·清除能力 参照Siddhuraju[9]的方法。配置0.625 g/L的Trolox母液、ABTS储备液、ABTS工作液(用20 mmol/L、pH 4.5醋酸缓冲溶液按适当比例稀释ABTS储备液，使A734 nm为(0.7±0.02)，以此得到ABTS+工作液)。将酱油稀释10倍，取样品提取液500 μL加至5 mL ABTS+·工作液中，混匀，避光反应6 min，测定734 nm处吸光值。将500 μL 50%的乙醇代替样品做空白对照。取500 μL一系列梯度的Trolox标准溶液，加至5 mL ABTS+·工作液中，混匀，避光反应6 min，测定734 nm处吸光值。按式(2)计算ABTS+·清除率。

(2)

式中：

C——ABTS+·清除率，%；

A1——样品溶液吸光度值；

A0——空白对照溶液吸光度值。

1.3.5 铁离子还原力 参照Benzie等[10]的方法。将0.3 mol/L 醋酸—醋酸钠缓冲液(pH 3.6)、0.01 mol/L TPTZ溶液、0.02 mol/L FeCl3溶液按体积比10∶1∶1混匀，配制6.25 g/L FeSO4标准溶液。将酱油稀释10倍，取样品提取液200 μL加至2.8 mL Fe3+-TPTZ试剂中，混匀，37 ℃水浴60 min，测定593 nm处吸光值，用去离子水代替样品提取液作空白对照。以FeSO4·7H2O为标准品绘制曲线。

1.4 数据处理

所有试验重复3次取平均值，采用Origin 2017软件绘图，采用Design-expert 8.0.6软件进行响应面设计，标准曲线采用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1可知，牡丹籽粕酱油中氨基态氮含量随发酵温度的升高先增加后降低，当发酵温度为45 ℃时达最大值。研究表明低温下肽酶的作用时间大于高温，说明低温有利于酶活的保存[11]，高温下蛋白酶活力会降低甚至失活[12]，同时高温促进了氨基酸和戊糖之间的美拉德反应，消耗了氨基酸[13]。氨基态氮含量随发酵时间的增加而减少，是由于发酵后期酶活力下降，基本不生成氨基态氮，同时酵母菌与耐盐乳酸菌繁殖以及美拉德反应会消耗部分氨基态氮[14]；当发酵15 d时，可溶性无盐固形物含量为9.34 g/100 mL，达不到低盐固态发酵酱油的标准(≥10 g/100 mL)，故选择最佳发酵时间为20 d。氨基态氮含量随盐水浓度的增加先上升后下降，当盐水浓度为11%时达最大值，氨基态氮含量下降是因为食盐含量增加，酶活力受抑制，降低了对蛋白质的分解能力[15]。综上，牡丹籽粕低盐固态发酵酱油的最适温度为45 ℃、发酵时间为20 d、最适盐水浓度为11%。

图1 各因素对牡丹籽粕酱油氨基态氮和可溶性无盐固形物含量的影响

2.2 响应面优化设计

2.2.1 试验设计与结果分析 根据单因素试验结果，以氨基态氮含量为响应值，根据Box-Benhnken中心组合原理进行响应面设计，试验因素水平表见表2，试验设计与结果见表3。

表2 试验因素水平表

表3 响应面试验设计与结果

利用Design-Expert 8.0.6软件对响应面试验结果进行多元回归拟合，得到以牡丹籽粕酱油氨基态氮含量(Y)为响应值的二次多项回归方程：

Y=0.60+0.030A+0.018B-0.030C-0.015AB+0.010AC+0.000BC-0.024A2-0.059B2-0.029C2。

(3)

为检验回归方程中各因素对牡丹籽粕酱油氨基态氮含量的影响程度及有效性，对回归方程进行方差分析，结果见表4。

表4 回归模型方差分析†

2.2.2 试验因素间的交互作用 由图2可知，发酵温度与盐水浓度之间的交互作用显著，其次依次为发酵温度与发酵时间、盐水浓度与发酵时间之间的相互作用。通过响应面的陡峭程度可以看出，发酵温度影响最大，发酵时间的影响大于盐水浓度，与方差分析结果一致。

图2 各因素交互作用对牡丹籽粕酱油氨基态氮含量的影响

2.2.3 验证实验 根据所建立的模型得到最佳发酵工艺参数为发酵温度45.42 ℃、盐水浓度12.02%、发酵时间17.86 d，此时酱油的实测氨基态氮含量预测值为0.623 g/100 mL。为检验响应面结果的可靠性，对最优工艺参数进行验证实验(n=3)，根据实际操作情况，将验证条件修正为发酵温度45.5 ℃、盐水浓度12%、发酵时间18 d，此时酱油的实测氨基态氮含量为0.616 g/100 mL，与预测值基本一致，证明用所建模型预测牡丹籽粕酱油氨基态氮含量是准确可行的。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH·清除能力 由图3可知，不同灭菌工艺的牡丹籽粕酱油的DPPH·清除能力不同。经灭菌处理后的牡丹籽粕酱油的DPPH·清除能力高于牡丹籽粕生酱油，可能是灭菌过程中生成了一些抗氧化物质，如多肽、氨基酸、类黑精和醛酮类风味物质[17]。牡丹籽粕生酱油的DPPH·清除能力高于市售品牌大豆酱油S2，与市售品牌大豆酱油S1的清除能力一致，且经灭菌后的牡丹籽粕酱油DPPH·清除能力高于市售的两种大豆酱油。表明牡丹籽粕酱油具有很强的DPPH·清除能力。

图3 酱油DPPH·清除能力

2.3.2 铁离子还原力 由图4可知，灭菌工艺对牡丹籽粕酱油还原力有一定影响，高温高压灭菌条件下牡丹籽粕酱油还原力较生酱油的提高了85.6%。恒温水浴、煮沸灭菌、巴氏灭菌条件下，牡丹籽粕酱油还原力较生酱油分别降低了10.8%，0.3%，3.0%，且这3种灭菌处理前后的还原力差异不明显，说明高温高压灭菌对牡丹籽粕酱油铁离子还原力有提高作用。高温高压灭菌工艺下的牡丹籽粕酱油(FRAP值为1.30 mmol/L)的抗氧化能力高于市售品牌酱油S1的，表明高温高压灭菌条件下的牡丹籽粕酱油抗氧化能力较强。

图4 酱油的铁离子还原力

2.3.3 ABTS+·清除能力 由图5可知，酱油对ABTS+·有一定的清除能力。高温高压灭菌的牡丹籽粕酱油的ABTS+·清除率(26.41%)最强，高于牡丹籽粕生酱油和市售品牌酱油S1。另一方面，高温高压灭菌的牡丹籽粕酱油的TEAC值为79.90 mmol Trolox/mL，抗坏血酸的为283.48 mmol Trolox/mg，表明3 μL酱油样品的ABTS+·清除能力相当于1 μg抗坏血酸的，说明牡丹籽粕酱油具有较强的抗氧化能力。

图5 酱油的ABTS+·清除能力

3 结论

试验表明，牡丹籽粕酱油的最佳发酵工艺条件为发酵温度45.5 ℃、发酵时间18 d、盐水浓度12%，此时牡丹籽粕酱油氨基态氮含量为0.616 g/100 mL。体外抗氧化活性表明，经高温高压灭菌的牡丹籽粕酱油的DPPH·清除能力、铁离子还原力及ABTS+·清除能力都高于牡丹籽粕生酱油，且高温高压灭菌的牡丹籽粕酱油的DPPH·清除能力高于两种市售大豆酱油S1、S2，表明高温高压灭菌下的牡丹籽粕酱油具有较好的抗氧化能力。试验仅涉及牡丹籽粕低盐固态发酵酱油的抗氧化性，并未研究其具体的抗氧化物质。因此，分离鉴别牡丹籽粕酱油具体的以及特有的抗氧化物质是后续研究的重点。