焦营营，曾晓媛，李宗鹏，张玉娇，刘启发，叶洁瑜

南方医科大学南方医院血液科，广东 广州 510515

原发性免疫性血小板减少症（ITP）虽然是非恶性疾病，但因高出血风险及明显乏力症状，患者生活质量非常差，甚至低于大部分癌症患者［1-2］。ITP一线治疗药物是糖皮质激素，有效率达70%～80%，但在药物减量或停药过程中有相当大部分患者出现复发，而对于这种激素耐药/依赖患者目前仍缺乏有效治疗方案。既往考虑血小板破环过多是ITP发病主要原因，近年来学者们强调血小板生成减少也是重要因素。然而，针对ITP患者血小板生成减少的研究仍十分局限，目前比较明确的发现仅仅是巨核细胞（MK）生成受抑制［3-4］，但其中具体机制尚不明确。血小板造血是极其复杂的生理过程，受到多种因素调控。即使血小板水平相同的ITP患者其出血症状却差异很大，这种强异质性现象提示还有一些未知因素参与ITP的发病。

机体的正常造血除了依靠造血细胞，还依赖于支持造血细胞生长发育的“造血微环境”，主要由成骨细胞、破骨细胞、骨髓内皮细胞及骨髓间充质干细胞组成［5］。巨核细胞的生长发育受到造血微环境中多种因素的精细调节［6］，微环境中的骨髓间充质干细胞及骨髓内皮细胞主要通过分泌细胞因子；以及通过细胞表面的粘附分子与巨核细胞相互接触，促进巨核细胞的成熟及迁移［7］。在病理状态下，体内的造血微环境也会发生改变［8］，进而影响巨核细胞造血。近期研究发现，ITP患者的内皮祖细胞（EPC）功能明显受损［9］；动物模型的电镜检查果提示，ITP组的动物内皮细胞超微结构与对照组明显不同，实验组的吞饮小泡减少，细胞间隙明显增大［10］；另外，ITP组动物的血浆vWF水平明显增高，这些都是ITP内皮细胞受损的表现。此外，本课题组前期研究发现：TPO可减少缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，从而发挥细胞保护作用［11］。因此我们推测，TPO可能通过修复内皮细胞功能，恢复其对MK细胞的造血支持作用，从而促进血小板生成。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年3月1日～11月31日在南方医科大学南方医院血液科22例确诊ITP患者的骨髓作为实验标本，并且获得健康供者捐赠的骨髓（n=10）作为健康对照组，患者和健康供者骨髓标本的获取均通过南方医科大学南方医院医学伦理委员会批准，并取得患者及健康供者知情同意。

1.2 试剂与仪器

BM-EC细胞来自ITP患者及供者,AnnexinV/PI凋亡试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），EBM-2培养基（广州优宁维生物科技有限公司），胎牛血清（广州优邦生物科技有限公司），24孔板及6孔板（广州杰特伟生物科技有限公司），TPO为临床剩余废弃，胰蛋白酶（英潍捷基贸易有限公司），CCK-8试剂盒（东仁化学科技有限公司），倒置显微镜（德国莱卡仪器股份有限公司）；AIRTECHVS-1300L-U超净工作台（上海整新电子设备厂）；自动定量酶标仪（Bio-Rad）；5%CO2恒温培养箱（香港Heal Force HF100型）；离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；FACSCaliburTM（BD Biosciences）流式细胞仪（Becton Dickinson）。鼠抗CD34/CD133/CD309（广州赛哲生物科技有限公司），Lonza-EGM-2培养基（上海优宁维生物科技有限公司）。DIL-AC-LDL（广州新进度生物科技有限公司），FITC-UEA(sigma)、青链霉素混合液（广州科进生物有限公司），基质胶（coring）（广州赛哲生物科技有限公司），明胶（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.3 内皮祖细胞分离、培养

采用淋巴细胞分离液分离法分离ITP患者及供者骨髓标本，获得单个核细胞，置于10%血清，1%双抗的EGM-2培养基（含内皮祖细胞生长因子）中重悬。以1×106/mL接种于预涂1%明胶的24孔板内。将所提取ITP患者的单个核细胞分两组：实验组加入浓度为100 ng/mL的TPO，对照组不添加TPO，同时按照上述提取BM-EPC方法提取健康人骨髓单个核细胞进行BM-EPC培养，作为健康对照组。将其放入37℃、5%CO2敷箱培养，每隔3 d换液，并观察细胞形态，长至80%～90%融合状态时弃去旧培养基，PBS清洗1～2次，加入0.25%EDTA胰酶放入37℃、5%CO2敷箱1 min左右，镜下观察当细胞皱缩、变圆、细胞间间隙变大时用含10%血清的完全培养基终止消化，轻轻吹打至细胞完全脱落，离心收集细胞传代。

1.4 细胞表面标志及鉴定方法

1.4.1 流式细胞术检测其表面CD34/CD133/CD309表达 收集不同处理组培养7 d的细胞，离心收集至流式管，调整细胞浓度为106/mL，分别加入5 μL的鼠抗CD34/CD133/CD309混匀置于4℃冰箱避光孵育20～30 min，PBS洗2次上机检测。

1.4.2 DIL-AC-LDL及FITC-UEA-1实验检测细胞内吞功能 首先将DIL-AC-LDL用EGM-2培养基稀释成2.5 μg/mL FITC-UEA-1生理盐水稀释至10 μg/mL。收集不同处理组培养7 d的细胞，弃去旧培养基，PBS轻轻清洗1～2次，加入DIL-AC-LDL（2.5 μg/mL）放置37 ℃、5%CO2敷箱3～4 h，取出后倒掉其液体PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min，其后弃去液体，PBS洗3次，每次5 min，加入 FITC-UEA-1（10 μg/mL）放置敷箱2 h，取出后PBS洗3次，每次5 min，置于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.5 细胞增殖实验

取对数生长期的ITP患者BM-EC，接种于96孔板中，96孔板周围边缘孔用无菌PBS填充，TPO以0、50、100、200 ng/mL不同剂量组加入96孔板中，使得总体积为100 μL。作用24 h后，将液体弃去，全部换为无血清EGM-2培养基，并加入10 μL CCK8试剂，反应2 h，酶标仪检测细胞吸光度A450nm。细胞增殖率（%）=［（实验组吸光度-空白组吸光度）（A450nm）（/对照组吸光度-空白组吸光度）（A450nm）］×100%。

1.6 细胞成管实验

预先将96孔板及枪头预冷，将50 μL Matrigel加入96孔板中，放入37℃孵箱中30 min。用胰酶消化各组BM-EC并用ECM培养基重悬，以2×104细胞（总体积50 μL）种入预先放有Matrigel的96孔板中，12 h后显微镜下观察，使用Image J.测量其管长度。

1.7 EPC与MK共培养实验

取不同处理组对数期生长状态的细胞，用胰酶消化BM-EC并用完全培养基重悬，以3×105细胞种于6孔板内，待其完全贴壁后加入1×105巨核细胞，37℃、5%CO2敷箱培养48 h后，收集细胞调整细胞浓度为106/mL，分别加入5 μL的鼠抗CD41a混匀置于4℃冰箱避光孵育20～30 min，PBS洗2次上机检测。

1.8 统计学分析

采用SPSS22.0对实验数据进行单因素方差分析；实验数据以均数±标准差表示；两样本比较采用配对t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内皮祖细胞形态观察

镜下细胞分离接种初期为单个核细胞形态，第3天细胞开始变大，有聚集成团的现象。5～7 d细胞开始出现不规则形、梭形；9～10 d为典型的EPC细胞形态（图1）。

2.2 流式细胞术检测其表面CD34/CD133/CD309表达

用流式细胞术检测不同处理组BM-EPC表面相关CD分子表达水平,结果显示，所培养的细胞表面表达CD34、CD309及CD133的细胞率占80%以上（图2）。

2.3 细胞增殖实验

TPO 0、50、100、200 ng/mL作用于BM-EPC 24 h，在100 ng/mLTPO作用下增殖率达到最大，这为理想的药物浓度，综合考虑选用100 ng/mL的TPO处理细胞进行相关实验（图3）。

2.4 细胞DIL-AC-LDL及FITC-UEA-1实验

采用免疫荧光方法检测不同处理组BM-EC DILAC-LDL及FITC-UEA-1双染阳性细胞数量，结果显示，不同处理组培养的BM-EPC均为阳性，并且TPO处理组明显高于未处理组（图4）。

2.5 细胞成管实验

不同处理组细胞接种在铺有Matrigel的96孔板中，12 h后的显微镜下结果（图5）。TPO处理组成管能力高于未处理组其结果差异有统计学意义（n=8，P＜0.05）。

2.6 EPC与MK共培养实验

使用6孔板直接共培养BM-EPC与MK，48 h后，流式上机检测不同处理组CD41a的表达，使用TPO处理组CD41表达明显高于未处理（图6）。

3 讨论

当前研究表明，ITP患者BM-EPCs功能受损，主要表现为增殖能力、成管功能及支持巨核细胞造血功能下降，在体外TPO处理后，EPCs数量明显增加，成管功能明显增强，共培养MK数量明显增多。TPO及c-mpl已被证实在除了造血干/祖细胞及巨核系统以外的多种细胞中表达。有文献报道内皮细胞及EPC均表达c-mpl，TPO通过c-mpl受体发挥生物学作用［12-13］；另有研究表明通过对骨髓移植后的小鼠输注BM-EPC可以加速移植后各系功能重建，促进HSC增殖［14］。此外，TPO刺激造血干细胞中的血管内皮细胞生长因子（VEGF）的产生，VEGF是对HSC生理至关重要的一种细胞因子［15］。本研究提示TPO对ITP患者BM-EPCs有促增殖及恢复其支持巨核细胞造血的作用。其机制可能是TPO通过增加EPCs数量，加大与巨核细胞间的直接接触，另一方面可能是通过促进分泌VEGF、SDF-1等细胞因子促进HSC向MK分化从而增强其支持巨核细胞造血功能［16］。但TPO处理后的BM-EPC是否可以通过增加造血因子的分泌影响巨核细胞造血，还需进一步研究。

BM-EPC在刺激因子作用下可分化成成熟内皮细胞，具有成管和迁移特性，对于新生血管的形成和血管的修复具有重要意义［17］。内皮细胞的成管功能是参与机体止血的重要环节［18］，ITP患者的出血症状不仅仅与血小板减少相关，可能与内皮的成管功能受损也有很大的关系。本研究结果表明，TPO可修复ITP患者EPC的成管功能；这可能是临床使用TPO类制剂，例如重组人血小板生成素以及TPO受体激动剂减少出血症状的机制之一［19-20］；同时也解释了一部分ITP患者即使血小板数量增高不明显，出血症状也可明显改善，可能与这部分患者EPC成管功能得以恢复有关。另外，文献报道TPO/c-mpl可激活Src激酶通路［21］，而Src-ERK通路在内皮细胞的成管功能中发挥重要作用［22］，故TPO是否也通过此通路修复EPC的成管功能仍有待进一步研究。

综上所述，TPO对ITP患者受损的内皮细胞具有修复作用，主要表现为成管功能及巨核细胞支持功能明显增强。本研究进一步完善了TPO的生理学作用及促巨核细胞造血的作用机制，为临床ITP患者合理使用TPO类试剂提供了理论依据。