韩志俊

（遵义医科大学基础医学院，贵州 遵义563000）

虎奶菇（Pleurotus tuber-regium） 又称核耳菇、茯苓侧耳等，是一种木腐真菌[1]。虎奶菇核有极强的抗病能力，而且药效保持时间很长，可以长年保存不腐、不变质[2]。虎奶菇的子实体和菌核均可食用或药用，特别是子实体中含有丰富的氨基酸、蛋白质等营养物质，是不可多得的美食[3]；虎奶菇还具有滋补强壮、解毒收敛的药用功效，对咳嗽、哮喘有神奇的疗效，而其药用功效的主要物质是虎奶菇多糖[4]。多糖又称多聚糖（polysaccharide），主要分为植物多糖和动物多糖两大类，研究表明多数食用菌均含有一定量的多糖[5]。虎奶菇多糖可以从其子实体或菌丝体发酵提取，也可以从其菌核中提取。其中，通过虎奶菇的子实体分离提取出的多糖因其组成成份多、化学结构复杂而受到广泛的关注。虎奶菇多糖具有调节免疫力、抗氧化、对高血糖和高血脂的抑制作用，而且在抵抗癌细胞和肿瘤方面的有很好的疗效，还有很多未知功效亟待发现[6]。通过对虎奶菇子实体多糖的提取工艺开展研究，并对其药理作用进行分析，以期为开发更多的虎奶菇多糖药物及保健产品提供参考。

1 虎奶菇子实体多糖的提取工艺研究

1.1 提取工艺简介

目前，虎奶菇子实体多糖主要是从虎奶菇干品或新鲜虎奶菇产品中提取分离得到，常用的提取方法有水提法、酶提法、酸提法、碱提法和超声波、微波等辅助提取方法[7]，通过比较几种虎奶菇子实体多糖的提取方法来确定最佳的提取工艺参数和条件，为虎奶菇资源的综合开发利用和虎奶菇多糖保健品和药品的加工提供理论依据。

1.2 试验材料

1.2.1 药品与试剂

无水乙醇，西安三浦化学试剂有限公司；纤维素酶（100 000 U·g-1），中山市鸿盛生物科技有限公司；果胶酶（100 000 U·g-1），夏盛（北京）生物科技开发有限公司；氢氧化钠、盐酸，西安斯坦利生物科技有限公司。

1.2.2 仪器与设备

DK-98-1电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；SHZ-III型循环水真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；BS323S电子分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司；PB-1 pH计，德国Sartorius公司；DHG-9003电热鼓风干燥箱，上海沪南科学仪器厂；SL3-120B超声波清洗机，上海舍岩仪器有限公司。

1.3 试验方法设计

1.3.1 虎奶菇子实体多糖的提取工艺

虎奶菇子实体经清洗、晾干、切片，在60℃下烘箱中干燥60 min后，上粉碎机制成粉末状，过80目筛后得虎奶菇子实体粉末备用。

1）水浸提虎奶菇子实体多糖

准确称取虎奶菇粉末2.0 g置于200 mL锥形瓶中，加入适量的蒸馏水，置于一定温度条件下的水浴锅中保温浸提一段时间，真空抽滤或离心得到滤液，将滤液真空浓缩至原体积的1/4后，加入4倍体积的无水乙醇，静置24 h后过滤或离心分离得到沉淀，将沉淀置于60℃条件下干燥即得虎奶菇子实体粗多糖。

2）超声波辅助提取虎奶菇子实体多糖

准确称取虎奶菇粉末2.0 g置于200 mL锥形瓶中，加入适量的蒸馏水，置于一定温度、一定功率条件下的超声波清洗机中处理一段时间，真空抽滤或离心得到滤液，将滤液真空浓缩至原体积的1/4后，加入4倍体积的无水乙醇，静置24 h后过滤或离心分离得到沉淀，将沉淀置于60℃条件下干燥即得虎奶菇子实体粗多糖。

3） 酶提法结合超声波辅助提取虎奶菇子实体多糖

准确称取虎奶菇粉末2.0 g置于200 mL锥形瓶中，分别加入一定量的酶及适量的蒸馏水，置于一定温度、一定功率条件下的超声波清洗机中处理一段时间，于100℃条件下保温5 min灭酶，然后真空抽滤或离心得到滤液，将滤液真空浓缩至原体积的1/4后，加入4倍体积的无水乙醇，静置12 h后过滤或离心分离得到沉淀，将沉淀置于60℃条件下干燥即得虎奶菇子实体粗多糖。

1.3.2 虎奶菇子实体多糖得率的计算

采用重量分析法来确定虎奶菇子实体多糖得率（E，%），计算公式为：

式中：W1为虎奶菇子实体多糖的质量（g）；W2为虎奶菇子实体粉末的质量（g）。

2 试验结果与分析

首先进行单因素试验，探讨固液比、浸提时间和温度等单一因素对热水浸提对虎奶菇子实体多糖提取效果的影响，其次再进行热水浸提的工艺参数优化。

2.1 热水浸提虎奶菇子实体多糖的单因素试验

2.1.1 固液比对虎奶菇子实体多糖提取效果的影响

准确称取虎奶菇子实体粉末2.0 g置于200 mL锥形瓶中，按固液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50分别加入蒸馏水10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL，置于温度为60℃条件下的水浴锅中保温浸提4 h，真空抽滤或离心得到滤液，将滤液真空浓缩至原体积的1/4后，加入4倍体积的无水乙醇，静置24 h后过滤或离心分离得到沉淀，将沉淀置于60℃条件下干燥得到虎奶菇子实体粗多糖，称重后计算虎奶菇子实体多糖得率。

试验结果表明，在固液比为（1∶10）～（1∶30）时，随固液比的增加多糖得率呈线性增加；但在（1∶30）～（1∶50） 时，虎奶菇子实体多糖得率先是缓慢增加后再下降。分析其原因可能是因为随着固液比的增大，溶剂中多糖总量有所增加；当固液比达1∶30时，多糖得率达到最大，此时细胞内外的浓度基本平衡；继续增大固液比对多糖的得率影响很小，且溶剂用量过大会增加后续的浓缩时间，能耗增大。因此，综合考虑选择固液比为1∶30比较合适。

2.1.2 浸提时间对虎奶菇子实体多糖提取效果的影响

准确称取虎奶菇子实体粉末2.0 g置于200 mL锥形瓶中，按固液比1∶30加入蒸馏水30 mL，置于60℃的水浴锅中保温浸提1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，真空抽滤或离心得到滤液，将滤液真空浓缩至原体积的1/4后，加入4倍体积的无水乙醇，静置24 h后过滤或离心分离得到沉淀，将沉淀置于60℃条件下干燥得到虎奶菇子实体粗多糖，称重后计算虎奶菇子实体多糖得率。

试验结果表明，浸提时间为1 h～3 h时，随时间延长虎奶菇子实体多糖得率逐渐增加；在3 h～5 h时，得率上升变得缓慢。这可能是因为时间过短溶质与溶剂的接触不充分，多糖得率低，随时间延长而多糖不断溶出进入到溶剂中，多糖得率随之增大。因此，综合考虑选择浸提时间为3 h比较合适。

2.1.3 温度对虎奶菇子实体多糖提取效果的影响

准确称取虎奶菇子实体粉末2.0 g置于200 mL锥形瓶中，按固液比1∶30加入蒸馏水30 mL，置于温度为20℃、40℃、60℃、80℃、100℃条件下的水浴锅中保温浸提3 h，真空抽滤或离心得到滤液，将滤液真空浓缩至原体积的1/4后，加入4倍体积的无水乙醇，静置24 h后过滤或离心分离得到沉淀，将沉淀置于60℃条件下干燥得到虎奶菇子实体粗多糖，称重后计算虎奶菇子实体多糖得率。

试验结果表明，当浸提温度为20℃～80℃时，虎奶菇子实体多糖得率随温度的升高逐渐增加，浸提温度为80℃～100℃时，多糖得率的增加变得缓慢。这是因为温度升高使得分子的热运动加快，有利于分子的溶出；但温度超过90℃时，可能会对多糖的生物活性产生影响，同时会造成更多的能源消耗。因此，综合考虑可选择浸提温度为80℃比较合适。

2.2 热水浸提虎奶菇子实体多糖工艺的优化

通过单因素试验确定了几个重要的参数范围，在此基础上再根据响应面原理[5]设计试验，试验因素与水平见表1。

表1 热水浸提试验因素与水平Tab.1 Factors and levels of hot water extraction test

如表1所示，通过组合设计对热水浸提法提取虎奶菇子实体多糖的固液比、浸提时间和浸提温度进行优化试验。

2.3 超声波辅助提取对虎奶菇子实体多糖工艺的优化

根据上述试验步骤，首先进行单因素试验，确定固液比为1∶30，超声处理时间为30 min，超声处理温度为65℃，超声处理功率为200 W。

在单因素试验的基础上，再进行超声波辅助提取工艺的优化，依据响应曲面设计的原理，对超声波辅助提取虎奶菇子实体多糖的固液比、超声时间、超声温度和超声功率4个单一因素进行优化，最终得到超声波辅助提取多糖的最佳工艺条件为：固液比1∶30，温度68℃，功率190 W，此条件下虎奶菇子实体多糖得率为9.87%。

2.4 酶提法结合超声波辅助提取虎奶菇子实体多糖工艺的优化

采用上述试验方法，首先进行单因素试验，选择纤维素酶作为提取用酶种类，固液比为1∶30，加酶量为0.5%，酶解pH 5；结合超声波辅助单一因素中，综合考虑酶解时间等因素，超声温度为50℃、超声时间为30 min、超声功率为200 W时比较合适。

其次，在酶提法结合超声波辅助提取虎奶菇子实体多糖工艺的优化上，对固液比、加酶量（纤维素酶）、超声时间和超声功率各因素进行优化试验，最终得到酶法结合超声波辅助提取食用菌多糖的最佳工艺条件为：固液比1∶30，加酶量0.6%，超声时间30 min，超声功率200 W，此条件下虎奶菇多糖得率为13.05%。