王 玉

(淮安市食品药品检验所，江苏 淮安 223300)

止咳丸是传统中成药品种，创制于清光绪33年，是由麻黄、陈皮、枳壳、紫苏子、甘草、黄芩(酒炙)等二十几种中药材加工制成的复方纯中药制剂[1]。该制剂收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十一册》，具降气化痰，止咳定喘之功效，可用于风寒入肺、肺气不宣引起的咳嗽痰多，喘促胸闷，周身酸痛或久咳不止，以及老年急慢性支气管炎，疗效卓著[2]。但现行质量标准只有显微鉴别和理化鉴别，局限性大，难以准确控制制剂质量，因此需要建立一种简便、准确的定量分析方法来控制其内在含量。本实验分析该方方剂组成，选择柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷作为本品的质控指标，为该制剂的质量控制和标准提高提供科学依据[3]。

1 仪器、药品与试剂

1.1 仪 器

UltiMate 3000高效液相色谱仪，DIONEX公司；XP-6电子天平，梅特勒电子有限公司；XS205-DU电子天平，梅特勒电子有限公司；KH72000数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；HWS26电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 药品与试剂

止咳丸(生产单位：昆明中药厂有限公司；批准文号：国药准字Z53021162；生产批号：281477、291859、291659)；柚皮苷对照品(纯度91.7%，批号：110722-201815)、橙皮苷对照品(纯度96.2%，批号：110721-201818)、新橙皮苷对照品(纯度99.2%，批号：111857-201703)，均购自中国食品药品研究院。

甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.2%冰醋酸溶液(31∶69)；检测波长：283 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

分别精密称取柚皮苷6.335 mg、橙皮苷3.170 mg、新橙皮苷2.911 mg置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀作为对照贮备溶液。

2.2.2 供试品溶液

取本品(生产批号：281477)适量，除去糖衣，研细，精密称取1 g，置具塞具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液

制备缺陈皮和枳壳的阴性对照样品，精密称取1 g，按“2.2.2”方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性实验

图1 对照品、供试品及阴性对照HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of standard sample, Zhike Wan sample and negative sample

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各5 μL，照“2.1”项下方法测定。结果显示，目标成分分离效果好，且阴性对照溶液在目标成分相同保留时间处未检出色谱峰。表明该方法专属性强。

2.4 线性范围考察

精密吸取对照贮备液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取5 μL注入色谱仪，记录色谱图，以浓度(mg/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。柚皮苷的回归方程：y=5.1331x(r=0.9996)；橙皮苷的回归方程：y=5.0754x(r=0.9999)；新橙皮苷的回归方程：y=54.9323x(r=0.9996)。

结果表明，柚皮苷在11.62～232.36 μg/mL、橙皮苷在6.10～121.98 μg/mL、新橙皮苷在5.78～115.5 μg/mL的范围内与面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液5 μL，连续进样6次，记录色谱图。结果显示，柚皮苷峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.15%，橙皮苷峰面积的RSD为0.78%，新橙皮苷峰面积的RSD为0.86%。

2.6 稳定性实验

取“2.2.2”项下供试品溶液，在0、1、2、4、8、12、24、48 h分别进样5 μL，注入色谱仪，记录色谱图。结果显示，柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷峰面积RSD分别为0.76%、0.88%、1.03%，说明该供试品溶液在48 h内基本稳定。

2.7 重复性实验

精密称取同一批号(生产批号：281477)供试品6份1.0007 g、1.0008 g、1.0041 g、1.0039 g、1.0038 g、1.0094 g，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，照“2.1”项下方法测定。结果表明，柚皮苷平均含量为1.95 mg/g，RSD为0.78%；橙皮苷平均含量为3.78 mg/g，RSD为0.46%；新橙皮苷平均含量为1.13 mg/g，RSD为0.83%。

2.8 加样回收率实验

精密称取已知含量的同一批(生产批号：281477；含量：柚皮苷含量为1.95 mg/g、橙皮苷含量为3.78 mg/g、新橙皮苷含量为1.13 mg/g)供试品6份，每份约0.5 g，分别精密加入一定量的3种成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，照“2.1”项下色谱条件分别测定柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率结果(n=6)Table 1 Results of recovery rate tests(n=6)

续表1

2.9 样品测定

取3批次止咳丸，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下方法测定，计算含量，结果见表2。

表2 样品测定结果Table 2 Results of content determination of samples

3 讨 论

3.1 提取条件的选择

实验过程中对提取溶剂(70%乙醇、甲醇、50%甲醇)、提取方法(超声30 min、回流30 min)、提取时间(回流30 min、回流1 h、回流1.5 h)、提取溶剂用量(25 mL、50 mL、100 mL)进行了考察[4-6]，结果表明以50 mL甲醇为溶剂，回流30 min的提取效果最好。

3.2 色谱条件的选择

本实验考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.2%冰醋酸作为流动相[7]。结果显示甲醇-0.2%冰醋酸(31∶69)分离度、对称因子最佳；另在实验过程发现，进样量为20 μL或10 μL时峰形均较差，对称因子过小，不符合要求，故设定进样量为5 μL。

此外，本研究从柱温(30 ℃、35 ℃、40 ℃)、流速(0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)和不同品牌色谱柱{Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)}三方面考察了该法的耐用性。结果显示：柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰均能实现良好分离。说明该法可靠。

3.3 结 论

止咳中成药在中成药中占有相当大的比例，而化学成分是治疗疾病的物质基础，但止咳丸现行质量标准无任何含量测定项目，这具有很大的局限性。方中的陈皮、枳壳是常用止咳药配方，而黄酮类成分为其主要活性成分[8-10]。本研究建立HPLC法，同时测定柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷三种成分，体现了一法多测的分析理念，能有效控制该产品的质量，也为止咳丸标准提高提供基础支撑。