骆雄飞，赵 娜，刘斯文，李华南，张 玮，王强松，王金贵△

(1. 天津中医药大学第一附属医院，天津 300193； 2. 国家中医药管理局推拿手法生物效应三级实验室，天津 300193； 3. 中国医学科学院生物医学工程研究所，天津 300192)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是常见的消化系统疾病，属于功能性胃肠病范畴，以持续或间歇发作的腹痛、腹胀、排便习惯和大便形状异常为临床表现。IBS影响全球5%～20%人的生活[1]，降低患者的生活质量[2]，其程度不亚于糖尿病、肝硬化、肾功能不全，故而日益受到关注。由于IBS发病机理的复杂和多元性，目前尚无特异性治疗方法。而传统中医学的推拿疗法在治疗IBS方面积累了丰富的经验，对于各亚型IBS具有独特疗效。

肠神经系统(enteric nervous system,ENS)-Cajal间质细胞(interstitial cell of Cajal, ICC)-胃肠平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)网络是目前肠动力研究的热点，ICC与肠神经及临近肌细胞间通过特殊的缝隙连接，形成ENS-ICC-SMC网络。ENS担负着胃肠道的神经反射和控制活动，调节肠道动力；ICC在神经肌肉信号传递中起调节作用，与胃肠道蠕动功能密切相关；SMC是调控肠动力的关键性因素之一。肠动力的完成离不开ENS、ICC和SMC三者的共同协作，其中任一部分发生病变必将导致肠动力功能紊乱。本课题组以便秘型IBS家兔为研究对象，以ENS-ICC-SMC网络为切入点，探讨腹部推拿调节便秘型IBS肠动力的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用2月龄家兔50只，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由天津裕达实验动物养殖有限公司提供(合格证号SCXK津2016-0001)。

1.1.2 主要试剂 Anti-C-kit antibody(Abcam,英国，批号ab5506)；Anti-nNOS antibody(Abcam,批号ab2801，英国)；Fura-2/AM(sigma美国)；Pluronic-F127(sigma美国)；溴化乙锭(Ethidium Bromide,北京鼎国)；正常熔点的琼脂糖凝胶(GIBCO,美国)；低熔点的琼脂糖凝胶(GIBCO,美国)；无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)；二甲苯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥)；苏木素染液(上海碧云天)。

1.1.3 主要仪器 EGEG-8D型八导智能胃肠电图仪(合肥凯利光电科技有限公司)；5415D型离心机(Eppendorf,德国)；PTC-200型热循环仪(Bio-Rad,美国)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS,日本)；TS-1型脱色摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；干燥消毒烤箱(DHG-9246A,上海精宏试验设备有限公司)；水浴恒温箱(DK-8,上海精宏试验设备有限公司)；组织切片机(ST-10,北京世联博研科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模方法 采用随机、对照研究方法，按照计算机随机数字表法将家兔分为空白对照组10只，模型对照组20只，腹部推拿组20只，采取冰水灌胃应激法造模[3]。模型对照组、腹部推拿组家兔分笼独立饲养，消除生物节律影响，每日晨8时冰水灌胃(0～4 ℃生理盐水，20 ml/只/d，14 d)，普通饲料喂养，自由进水。

1.2.2 干预方法 腹部推拿组：研究者掌指关节自然伸直，四指并拢，以食指中指罗纹面接触实验家兔腹部关元和气海穴。以肘关节带动前臂做环形运动，以研究者食指中指面着力于实验家兔腹部做顺时针揉动，频率30圈/min，操作5 min。造模结束后开始，每日治疗1次，连续治疗14 d。模型对照组：每日仰卧捆绑实验家兔1次10 min，不给予腹部推拿，连续14 d；空白对照组：不给予任何干预。

1.2.3 观察指标及检测方法 排便情况：自造模开始，每日收集空白对照组、模型对照组、腹部推拿组家兔粪便，固定托盘收集后150 ℃烘干1.5 h，电子秤称重烘干前后质量，根据公式(烘干前-烘干后)/烘干前=含水率%，计算出每只家兔粪便含水率。验证造模成功及干预效应的标准为粪便含水率呈趋势变化。胃及结肠肌电检测：在实验兔的胃与结肠体表投影处及左前肢腕关节上0.5 cm(放置参考电极)剪毛，用950 ml/L乙醇脱脂，将8个直径0.7 cm的Ag2agcl圆盘电极用9.0 g/L氯化钠注射液棉球覆盖，电极放置顺序。胃电：胃底-胃小弯-胃大弯-幽门；肠电：升结肠-横结肠-降结肠-直肠，胶布固定，用胃肠电图仪记录10 min肠电图，以1 min为一个时间段，分别计算每个时间的频率(单位：Hz)和振幅(单位：mv)，记录观察结肠电信号变化；结肠传输功能检测：制备壳聚糖/海藻酸钙控释微球[4]，制备异硫氰酸荧光素(FITC)标记壳聚糖。实验前禁食24 h，自由饮水；FITC标记微球用蒸馏水分散均匀，各实验组按照50 mg/kg体质量给家兔灌胃，灌胃后分别在不同时间点(16、24 h)取胃、小肠、结肠三部分，使用小动物成像仪观察FITC标记交联微球在家兔胃肠道的分布情况；ENS-ICC结构观察：迅速取出结肠组织，将组织剖开去除内容物，在解剖显微镜下用显微解剖镊将黏膜层和黏膜下层作为一层剥除，保留完整肌层制备石蜡切片。脱蜡后做C-Kit/nNOS免疫荧光双重标记，封片剂封片后荧光显微镜下观察图像；电镜观察ENS-ICC-SMC超微结构，迅速用冷刀片取结肠组织，长度为1 cm。沿系膜缘剖开，用冰盐水漂洗去除内容物，立即放入2.5%冷戊二醛溶液，放入4 ℃冰箱固定24 h。用0.2MPBS漂洗4次，每次15 min，再用l%0s04固定1.5 h，用0.2MPBS漂洗15 min。梯度丙酮50%、70%、90%、100%中脱水各4次，每次15 min；100%丙酮：环氧树脂(1∶1)1 h，然后100%丙酮：环氧树脂(1∶2)2 h，再纯树脂3 h以上。先滴1滴环氧树脂至塑料胶囊，再将样品挑入囊底插入标签，灌满环氧树脂，用针尖调整样品至合适位置，放入恒温箱(60 ℃)聚合12 h。半薄切片(厚1.0～2.0 μm)，2%甲苯胺蓝染色，在光镜下观察、确定黏膜层、环形肌层、纵行肌层。选定区域修块进行超薄切片，超薄切片厚50～70 nm，400目铜栅网捞片。2%醋酸铀染色15 min，柠檬酸铅染色5 min，晾干。透射电镜观测比较各组ENS-ICC-SMC超微结构变化并拍照。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 腹部推拿对便秘型IBS模型家兔粪便含水率影响

图1示，模型对照组家兔粪便含水率呈逐渐降低趋势并低于空白对照组，腹部推拿干预后，粪便含水率有恢复趋势。

图1 各组家兔粪便含水率变化比较

2.2 腹部推拿对便秘型IBS模型家兔胃肠电活动的影响

表1示，相对于模型对照组，腹部推拿组胃电活动平均幅值有升高趋势，差异无统计学意义；相对于模型对照组，腹部推拿组肠电活动平均幅值与平均频率明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。表明腹部推拿可以有效刺激肠蠕动，增强肠电活动幅值和频率，改善肠动力障碍兔的肠电活动损伤。另外，腹部推拿组肠电幅值和频率高于空白对照组，可能与腹部推拿的即时效应有关。

表1 各组家兔胃肠电活动变化比较

注：a.空白对照组；b.模型对照组；c.腹部推拿组图2 小动物成像系统观察各组家兔不同时间消化道内胃、小肠、结肠内FITC标记微球分布情况

2.3 腹部推拿对便秘型IBS模型家兔消化道内FITC标记微球分布的影响

图2示，分别测定家兔插管灌胃后16 h和24 h后在胃肠道的分布情况。在家兔插管灌胃16 h后，空白对照组家兔FITC标记微球主要分布在小肠，结肠有很少荧光强度的微球；而模型对照组主要分布在胃部，小肠和结肠有很少荧光强度，而腹部推拿组家兔结肠荧光强度增强。24 h后荧光强度示，空白对照组结肠部位有一定强度的荧光，胃部荧光较少，模型对照组胃部有少量荧光，小肠和结肠有一定强度的荧光；而腹部推拿后家兔结肠荧光明显增强，与16 h结果相似。

2.4 腹部推拿对便秘型IBS模型家兔ENS-ICC结构中C-Kit和nNOS表达的影响

图3示，相对于空白对照组，模型对照组C-Kit和nNOS的表达明显减少且形态不明显；经腹部推拿后，C-Kit和nNOS的表达明显增加且形态明显。

注：a.空白对照组；b.模型对照组；c.腹部推拿组图3 免疫荧光染色观察各组家兔结肠组织中ENS-ICC结构中C-Kit和nNOS表达

2.5 腹部推拿对便秘型IBS模型家兔ENS-ICC-SMC超微结构的影响

图4示，空白对照组ICC细胞形态结构清晰，呈长梭状，核膜完整，胞质中有大量线粒体。SMC形态结构正常，核膜完整，能看到丰富的细胞器，如线粒体内质网等。相邻ICC之间连接紧密，ICC与周围SMC形成紧密的缝隙连接。而模型对照组ICC细胞形态较模糊，有一个长突起，胞质较少，SMC核体较小，核膜尚完整，可见有肿胀的线粒体，与周围细胞连接松散，ICC与周围SMC之间连接松散，未见有缝隙样连接。经腹部推拿干预后，ICC细胞形态结构清晰，呈长梭状，核膜完整，胞质中能看到线粒体。SMC形态结构正常，核膜完整。ICC与周围SMC形成紧密的缝隙连接，与邻近神经纤维末梢形成突触样连接，ENS-ICC-SMC结构完整。

注：a.空白对照组；b.模型对照组；c.腹部推拿组图4 投射扫描电镜分析各组家兔结肠组织中ENS-ICC-SMC超微结构比较

3 讨论

IBS因其临床症状复杂，潜在发病机制尚不明确，当前现代医学对其临床治疗乏善可陈，尚无治愈该病的手段，改善症状的药物和非药物治疗方案的临床疗效亦有待确定。目前对于该病的病理研究表明，其发病与ENS-ICC-SMC网络有密切关系。

ENS作为胃肠道内由兴奋性神经元和抑制性神经元组成的神经节，其神经元与神经纤维的数量、形态是维系胃肠道调节功能正常的基础。ENS损伤、变性、缺失会引起肠道运动、分泌功能异常[5]。同时ENS与作为肠道起搏细胞的ICC紧密伴随，对胃肠功能进行局部调节，是调节肠道动力的重要因素[6]。ICC作为一种非神经细胞，大量研究证实ICC数量和形态异常对动力障碍性疾病(如胃排空异常、慢传输型便秘、Oddi括约肌功能障碍和其他胃肠动力障碍相关疾病)有很大影响[7]，同时与神经活动有着特殊的连带关系。其通过调节神经肌肉信号传递，改变胃肠道的蠕动功能。SMC作为调控肠动力的另一关键性因素，其发挥作用主要由离子通道的激活来控制平滑肌细胞收缩等许多生理过程。

肠动力的正常运转离不开ENS、ICC和SMC三者构成的ENS-ICC-SMC网络神经递质释放、介导、传递等一系列反应，最后产生结肠蠕动的机械效应。因此，ENS-ICC-SMC结构中发生病变或破坏将导致肠动力功能紊乱。

推拿手法直接作用于人体，以力为作用特征。在手法作用力下，产生能量转换和生物电等信息传导，进而刺激机体产生各种生物学效应。已证实外界机械力可以引起细胞生物力学环境改变，产生的机械应力可改变细胞形态、结构，同时还能调控细胞的功能状态，影响细胞的增殖、分化[8-10]。当手法作用于腹部时，力以机械波的形式传入细胞，在细胞质或细胞核的效应部位(如核糖体、线粒体)转变为生物效应，其作用可引起细胞形貌的改变；机械力信号也可能转变成生物信号的过程引起细胞的生化和生理应答[11]，可能影响ICC、肠神经元、肠平滑肌细胞的增殖和凋亡。

本研究综合应用分子生物学、透射电镜等现代多学科的研究技术，对肠动力障碍兔结肠组织中ENS变化及ICC和SMC网络超微结构观察分析，说明腹部推拿可干预消化道动力产生与调节的基本功能单位，其调节IBS胃肠动力障碍的作用可能与其对肠ENS-ICC-SMC结构的影响有关，在一定程度上揭示其防治肠动力障碍性胃肠病的作用机制。

中医认为腹部居人体之中，为上下联结的枢纽。《厘正按摩要术》曰：“胸腹者，五脏六腑之宫城，阴阳气血之发源，若欲知其脏腑何如，则莫如诊胸腹。[12]”五脏六腑尤以脾胃在腹部推拿中具有重要的地位，这与其所处的位置和生理作用密切相关，也是腹部推拿治疗消化系统疾病的原理所在。尽管从中医角度采用腹部推拿治疗脏腑疾病，尤其是肠动力障碍引发的功能性胃肠病具备一定理论基础，但其现代医学作用机制的研究尚处于初级阶段且尚未明确。因此，进一步阐明腹部推拿治疗肠动力障碍引起的功能性胃肠病的作用机制，有助于提高其临床应用水平，对于深化腹部推拿基础研究、促进推拿学科发展具有重要意义。