孙晓萌 李潇 朱笳悦 韩朔 杨鑫伟 许利平

糖尿病周围神经病变(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)是糖尿病常见的慢性并发症之一,其高发病率和高致残率严重影响人们的生活和质量,寻找治疗的有效药物,是目前一直研究和观注的重点。雪旺细胞(Schwann cells,SCs)作为周围神经系统的特有胶质细胞,在神经损伤与修复过程中发挥重要作用[1]。高糖环境下SCs的正常代谢过程被破坏,从而使神经毒性的终产物积累,影响神经营养因子,导致细胞凋亡[2]。已有研究表明芍药苷(paeoniflorin,PF)可以促进高糖培养的SCs的增殖,对抗高糖环境对SCs增殖的抑制作用[3],并有可能是潜在的神经生长促进因子[4]。课题组近期研究发现线粒体相关内质网膜(mitochondriaassociated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)参与了SCs的代谢过程,糖尿病周围神经病变的发病机制与MAMs密切相关,本实验以MAMs为切入点,围绕PF调控MAMs膜上功能蛋白和钙离子参与SCs凋亡,试图阐明PF对高糖环境下SCs凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和药品

雪旺细胞株RSC96,为中医络病研究北京重点实验室保存细胞株。

芍药苷,购于中国药品生物制品检定所,批号：110736-201035

1.2 主要试剂

葡萄糖(G8150,Sigma)；无水甲醇(20180226,北京化工厂)；PBS(P1020-500,Solarbio)；ER-tracker(P1041,Beyotime)；Mito-tracker(P1048,Beyotime)；高效RIPA组织/细胞裂解液(R0010-100,Solarbio)；anti-Mitofusin2抗体(ab124773,abcam)；DMEM(PM150210,Procell)；胎牛血清(16000-044,Gibco),DMSO(Sigma,D2650-100ml)。

1.3 主要仪器

手持式细胞计数仪(Millpore,AH01YOUQ)；低温离心机(Sigma,3K15)；超速离心机(BECKMAN,L-80XP)；高级研究型显微镜(Nikon,ECLIPSE 80i)；定制型流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company,BD LSRFortessa)；激光共聚焦显微镜(Leica,TCS SP8)；透射电子显微镜(Hitachi,HD7700)；基础电泳仪电源(PowerPacTM),电泳槽(Mini-PROTEAN®Tetra),转印槽(Trans-Blot®),均来自Bio-Rad。

1.4 细胞处理、分组与蛋白样品提取

1.4.1 RSC96细胞复苏与传代 从-80℃低温冰箱中取出冻存细胞后迅速放入37℃水浴锅内温浴1分钟,将细胞悬液加入预先加过培养基的离心管内1000 r/min离心5分钟,弃上清,使用新鲜培养基重悬细胞沉淀,接种于新的培养瓶或培养皿内,常规培养。……