董鹏 朱三荣 蔡海林 周向平 滕凯 匡传富 单雪华 戴良英 唐前君 周志成 刘天波

摘  要：为明确湖南烟草病毒病的种类及分布状况，利用小干扰RNA（siRNA）测序和反转录PCR（RT-PCR）对湖南烟区样品进行检测，分析主要病毒侵染类型，最大似然法构建系统进化树确定分类地位。结果表明，湖南烟草受到烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y， PVY）、番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus，ToMMV）、地黄花叶病毒（Rehmannia mosaic virus，ReMV）和辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMV）等6种病毒的侵染，其中ToMMV、ReMV、PMMV首次被检测到，TMV、CMV和PVY是主要病毒，TMV为优势病毒，复合侵染是主要侵染类型，复合侵染率为71.29%;湖南烟草上的TMV分离物形成3个独立组系，CMV分离物属群组I的亚组IB，PVY分离物属PVYNTN-a、PVYE和PVYSYR-I株系。本研究摸清了湖南烟草病毒种类、分布及侵染情况，明确了TMV、CMV、PVY的分类地位，为病毒病的防治提供了理论依据。

关键词：烟草病毒病;siRNA检测;侵染类型;系统进化分析

Abstract： Small interfering RNA （siRNA） and RT-PCR were used to detect the samples for determine the species and distribution of tobacco virus diseases in Hunan province， and the main virus infection types and the taxonomic status were clarified. The results showed that there were Tobacco mosaic virus （TMV）， Cucumber mosaic virus （CMV）， Potato virus Y （PVY）， Tomato mottle mosaic virus （TMV）， Rehmannia mosaic virus （ReMV） and Pepper mild mottle virus （PMMV）. Among them， ToMMV， ReMV and PMMV were tested in the first time in Hunan tobacco. TMV， CMV and PVY were the main viruses， and TMV was the dominant virus species， the mix-infection rate was 71.29%. TMV isolates in Hunan tobacco area formed three relatively independent populations， CMV isolates belonged to subgroup IB of group I， and PVY isolates belong to PVYNTN-a， PVYE and PVYSYR-I. In this study， the species， distribution and infection type of tobacco virus in Hunan tobacco area were found out， and the taxonomic status of TMV， CMV and PVY were clarified， which provided a theoretical basis for the prevention and control of tobacco virus diseases.

Keywords： tobacco virus disease; siRNA detection; infection type; phylogenetic analysis

煙草病毒病是烟草上普遍发生的一类病害，分布广泛，危害严重，直接影响烟叶的产量和品质，给烟叶生产带来较大的损失[1]。目前中国已鉴定的烟草病毒病有近25种，主要有烟草普通花叶病毒病（Tobacco mosaic virus， TMV）、黄瓜花叶病毒病（Cucumber mosaic virus， CMV）、马铃薯Y病毒病（Potato virus Y， PVY）、烟草蚀纹病毒病（Tobacco etch virus， TEV）和烟草脉带花叶病毒病（Tobacco vein banding mosaic virus， TVBMV）[2-3]。近年来，我国烟草病毒病危害呈日趋严重且复杂多变的趋势，同一烟区不同年份引起烟草病毒病流行的优势毒原不断变化，多种病毒复合感染现象日益严重，一些新病毒侵染烟草越来越多[4-5]。湖南是我国烟草主产区，病毒病严重影响湖南烟叶产量和质量。肖启明等[6] 在上世纪90年代提出了湖南烟区病毒主要有CMV、TMV、PVY和烟草环斑病毒（Tobacco ring spot virus，TRSV）等，CMV为优势病毒。巢进等[7]检测发现湖南烟区的病毒病主要是TMV和CMV，优势病毒已由CMV转变为TMV。滕跃辉[8]、齐益[9]、刘春如等[10]分别对湖南长沙、永州和衡阳烟草病毒进行检测，发现主要病毒是TMV、CMV和PVY，三者复合侵染现象普遍。随着气候、耕作制度、种植品种、产区调整等变化，湖南烟草病毒病种类是否发生变化尚不清楚。因此，重新调查湖南烟草病毒病种类，明确优势种类及侵染情况，对指导烟草病毒病防控具有重要意义。本研究从湖南烟区取样，利用小干扰RNA（siRNA）测序和RT-PCR检测，分析湖南烟草TMV、CMV和PVY的分布、侵染类型和分类地位，旨在明确目前湖南烟草病毒病的种类和分布情况，为病毒病的防治提供依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

2017—2018年从湖南郴州、永州、长沙、衡阳、湘西州等5个烟区采集表型为花叶、畸形、闪电纹、脉坏死、蚀刻、环斑、皱缩等烟草样品303份，样品经液氮速冻后于?80 ℃冰箱中保存备用。

1.2  烟草总RNA的提取

取1 g烟叶样品，使用TransGen Biotech公司的EasyPure? Plant RNA Kit试剂盒提取总RNA，具体方法参照试剂使用说明。提取的RNA于?80 ℃保存。

1.3  siRNA测序

小RNA文库构建及测序均由测序公司完成。siRNA测序文库制备采用TruSeqTM Small RNA Sample Prep Kits（Illumina， San Diego， USA）试剂盒，测序平台为Illumina Hiseq 2000/2500。

1.4  样品siRNA测序病毒分析

参照王浩军等[11]的方法去除低质量、未插入3'接头和5'接头的reads，选取不小于18 nt的reads。所得序列去除3'接头，处理后的序列用软件velvet version 1.1.06 进行短序列组装，组装的重叠群分别寻找高度同源序列（同源性大于90%）和部分同源序列（同源性低于90%），筛选与已知病毒序列具有同源性的重叠群。

1.5  病毒RT-PCR验证

以siRNA测序分析获得的病毒重叠群为参考序列，根据文献报道合成不同病毒的特异检测引物（表1），采用RT-PCR方法验证测序结果，进一步确定样品中病毒种类。

1.6  TMV、CMV和PVY的检测

参照杨金广等[12]报道的TMV、CMV和PVY检测引物和体系，进行PCR扩增，PCR产物送测序公司测序，计算检出率。

1.7  TMV、CMV和PVY 系统发育分析

以检测获得的湖南烟区部分TMV、CMV和PVY的分离物CP基因序列为对象，结合NCBI上下载的不同国家或地区侵染烟草TMV、CMV和PVY CP基因序列，分别选取近缘物种番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus， ToMV）、花生矮化病毒（Peanut stunt virus， PSV）和马铃薯X 病毒（Potato virus X， PVX）分离物作为外群，样品编号或登记号和来源地区或报道国家见表2。采用MEGA 5.0中的Clustral W[17]軟件进行序列比对，利用最大似然法（Maximum likelihood， ML）构建系统进化树，明确TMV，PVY和CMV的分类地位。

2  结  果

2.1  siRNA测序检测病毒种类

2.1.1  siRNA测序结果  siRNA测序得到21047020个reads （共组装成4083条重叠群），对获得的序列进行短序列组装，从组装的重叠群中寻找高度同源序列和部分同源序列，筛选与病毒同源的重叠群。从比对结果看，4083条重叠群中有4057个高度重叠群，与TMV、PVY、CMV、番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus， ToMMV）、地黄花叶病毒（Rehmannia mosaic virus， ReMV）、辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus， PMMV）和甜椒斑驳病毒（Bell pepper mottle virus， BPeMV）等7种病毒高度同源，TMV、PVY、CMV居前3位（图1）。

不同烟区的测序结果发现（表3），长沙、衡阳和永州等3个烟区TMV和PVY同源重叠数居前二位，郴州和湘西烟区TMV和CMV居前二位，说明TMV、PVY和CMV是湖南烟区主要病毒。在永州、郴州样本中还检测到了20个重叠群与番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV），6个重叠群与BPeMV部分同源的病毒。

2.1.2  siRNA测序结果验证  采用RT-PCR方法对siRNA测序得到的可能存在的8种病毒进行验证，结果显示，能够检测到TMV、CMV、PVY、ReMV、ToMMV、PMMV等6种病毒目的条带（图2），没有检测到ToMV和BPeMV，RT-PCR产物测序的结果与目的片段序列一致，确证烟草样品中存在这6种病毒，而ToMV和BPeMV可能不存在。

2.2  TMV、CMV和PVY检出率及侵染情况

2.2.1  TMV、CMV和PVY检出率  利用RT-PCR检测TMV、CMV、PVY 3种主要病毒（表4），结果发现TMV检出率最高，为83.2%，其次为CMV（63.04%）和PVY（42.9%）。衡阳、郴州、永州、湘西烟区检出率趋势一致，表现为TMV>CMV> PVY，长沙烟区为TMV>PVY>CMV。5个烟区TMV检出率均在80%以上，最高为衡阳（84.85%），CMV检出率最高为湘西州（67.19%），PVY检出率最高为长沙（70%）。

2.2.2  TMV、CMV和PVY侵染情况分析  从侵染

类型看（表5），单一病毒侵染率为28.71%，复合侵染率为71.29%。单一病毒侵染率最高为TMV（15.51%），其次为CMV（7.59%）;复合侵染检出率最高为TMV+CMV（35.97%），其次为PVY+TMV+ CMV（17.82%）。从地区分布来看，5个烟区单一侵染率最高均为TMV，最低有所不同，长沙、衡阳、郴州、永州单一侵染最低为CMV，湘西州最低为PVY;衡阳、郴州、永州复合侵染率最高为TMV+ CMV，最低为CMV+PVY;长沙最高为TMV+CMV+ PVY，最低为CMV+PVY;湘西最高为TMV+CMV，最低为TMV+CMV+PVY。

2.3  TMV、CMV和PVY系统进化分析

2.3.1  TMV 系统进化分析  由图3看出，不同烟区TMV分离物属于不同组系，亲缘关系相对较远，其中湘西花垣分离物与Shanxi-China分离物属同一个分支，衡阳常宁、衡阳县和永州宁远分离物与其亲缘关系较近;郴州嘉禾和湘西永顺分离物与Yunnan-China分离物亲缘关系较近，永州江永、江华和新田分离物，衡阳衡南和耒阳分离物与tNK-Russian和pet-Korea分离物属同一个分支，长沙浏阳、郴州永兴和湘西龙山分离物与它们的亲缘关系较近;郴州桂阳分离物与vulgare-Germany和a-Spain分离物属于同一个分支，长沙浏阳和湘西凤凰分离物与它们的亲缘关系相对较近。说明湖南烟草上TMV分离物存在比较广泛的遗传多样性。

2.3.2  CMV系统进化树分析  由图4看出，CMV分离物均处在同一分支，属于组系I中的亚组IB，可见湖南烟草上CMV分离物变异程度低，遗传多样性低。长沙宁乡分离物与Tfn-Italy-IB株系和NT9-Tai-Wan-IB株系亲缘关系最近，其他烟区分离物与SD-China-IB株系亲缘关系近。

2.3.3  PVY系统进化树分析  由图5看出，不同烟区PVY分离物处于不同分支，分属不同株系類型，长沙浏阳和宁乡分离物，湘西凤凰和花垣分离物， 郴州嘉禾、永兴和宜章分离物，永州宁远和湘西龙山分离物遗传距离较近，属于PVYSYR-I株系;湘西永顺分离物属于PVYNTN-a株系;郴州桂阳和衡阳县分离物属于PVYE株系;永州江华、江永和新田分离物，衡阳衡南、常宁和耒阳分离物分别形成独立分支，可能为新株系类型。表明湖南烟草上PVY分离物存在较大的遗传差异，可能存在新株系类型。

3  讨  论

病毒病是烟叶生产上的一类重要病害，分布广泛、类型多样。利用siRNA测序检测发现湖南烟区有TMV、CMV、PVY、ReMV、ToMMV和PMMV等6种病毒，首次检测到ToMMV、ReMV、PMMV，但未检测出马铃薯X病毒、烟草蚀纹病毒和烟草环斑病毒，可能与烟草品种差异或者采样覆盖面低有关。因此，为了全面反映湖南烟草病毒的现状，尚需增加待测病毒取样范围和样品类型。

随着全球气候的变化、耕作制度变革和农业产业结构调整，烟草主要病毒病不断变化。20世纪60年代前， TMV危害最严重，60年代CMV危害日趋严重，70年代以TMV、TMV与CMV复合侵染为主;90年代PVY由次要病害上升为主要病害，20世纪末至21世纪初PVX危害逐渐加重[17];2009—2012年，全国烟草病毒已由PVY转为TMV和CMV[18]。就湖南烟区而言，肖启明等[6]、巢进等[7]分别在1993年和2008年检测发现湖南烟草优势病毒分别是TMV和CMV。本研究发现湖南烟草TMV检出率最高，其次为CMV和PVY，TMV为优势病毒。可见，湖南烟草优势病毒已由CMV转为TMV，结果与刘勇等[19]、罗朝鹏等[20]研究结果一致。

病毒在田间复合侵染发生普遍，复合侵染已成为病毒危害的主要方式。青玲等[2]研究结果发现我国7个主要烟区5种病毒存在9种复合侵染，复合侵染率为62.26%。罗朝鹏等[20]发现湖北、云南、贵州等省不同年份主要病毒种类和复合侵染类型不同。刘勇等[19]和巢进等[7]在2006年和2008年检测发现湖南烟草病毒复合侵染率分别为28.38%和5.96%。本研究发现湖南烟草病毒复合侵染率为71.29%，单一侵染率仅为28.71%。可见，湖南烟区病毒复合侵染已成为主要侵染类型，且日益严重。推测可能是随着植烟时间延长，特别是长期的连作，病毒在田间积累日益增多;生产上缺少高抗品种，且品种比较单一，加重了病毒病的发生，从而也加重了病毒的复合侵染。

我国烟草上TMV的种群遗传结构相对比较保守，而CMV种群内遗传分化现象明显，具有丰富的遗传多样性，PVY株系分化现象也比较明显，具有多个株系[21]。宋丽云[22]对我国17个植烟区TMV分离物分析发现51个分离物同属一个种群，来自不同地区的分离物之间其基因序列表现出一定的差异和分化。刘勇等[19]检测发现湖南烟区CMV株系主要为亚组I，占比94.1%。赵雪君等[23]发现四川烟区PVY有着明显的株系分化现象，PVYN：O、PVYO、PVYN均有发生。谢思等[24]发现湖南烟区PVY优势株系为PVYN，PVYE株系少量发生，且首次在湖南检测到PVYNTN株系。本研究发现湖南烟区TMV分离物形成3个相对独立的种群，不同烟区的TMV分离物亲缘关系相对较远，种群间具有一定的地理特异性;CMV分离物处于同一分支，属组系I中的亚组IB;PVY分离物属不同株系类型，大多数属PVYSYR-I株系，也有湘西永顺分离物属PVYNTN-a株系，郴州桂阳和衡阳县分离物属PVYE株系，永州和衡阳分离物可能为重组新株系。TMV、CMV株系情况与宋丽云[22]、刘勇等[19]研究结果一致，PVY株系情况与赵雪君等[23]研究结果稍有不同，与谢思等[24]的结果差异很大。在研究系统进化上，ML法是较为常用的一种方法。然而，仅仅基于CP基因进行系统分析，也可能导致误判，还需基于不   同功能基因进一步分析。下一步将综合应用系统发育、重组和遗传进化分析等方法，研究湖南烟草主要病毒变异进化规律，为病毒病防治提供理论支撑。

4  结  论

从湖南烟区采集了303个烟草病毒病样品，共检出TMV、CMV、PVY、ToMMV、ReMV、PMMV等6种病毒，其中TMV为优势病毒。病毒复合侵染为主，TMV+CMV复合侵染检出率最高。TMV分离物形成3个相对独立的组系，所有CMV分离物属于群组I的亚组IB，PVY分离物分属PVYE、PVYNTN-a和PVYSYR-I株系。本研究摸清了湖南烟区病毒种类、分布及复合侵染情况，为病毒病的防治提供了理论依据。

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