杨婧娟，赵声兰，马雅鸽，杨薇，陈伟，张希*

云南中医药大学（昆明 650500）

近年来，心血管疾病已成为现代社会威胁人类健康的头号杀手，合理选择天然药用资源并开发为保护心血管的健康产品有巨大的经济和社会价值。黄精是我国传统药食两用资源，含有黄精多糖、皂苷、黄酮、生物碱等活性成分，有良好的降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化、调节血糖、抗肿瘤、提高免疫力、抗氧化等功效[1]，极具开发价值。

然而，生黄精具有刺激性，表现为麻舌感、刺激咽喉等，不适宜直接食用，因而影响其在大众日常保健中的应用。试验采用发酵方法对黄精先进行预加工，利用微生物的生物转化作用使黄精中关联化学成分发生组分转化或结构变化[2-4]，从而降低其刺激性，甚至使某些功能活性增强[5-6]。以发酵加工后的黄精为主要原料，复配枸杞、陈皮、绿茶为辅料进一步制成袋泡茶。枸杞富含枸杞多糖、黄酮类、生物碱等活性成分[7]，陈皮中有丰富的黄酮类化合物如芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素和挥发油等[8]，绿茶中也含有丰富的多酚类物质。研究显示，黄酮类化合物可通过抑制脂质过氧化、下调炎症因子、激活AMPK和转录因子-κB等信号转导通路等发挥保护心血管的作用[9]；茶多酚能通过改善内皮功能、抗炎等途径有效预防动脉粥样硬化[10]。因此，将这些天然植物资源复合使用，能协同发挥保护心血管健康的作用，而且制备为方便的袋泡茶形式，对于满足大众追求“绿色、天然、健康、便捷”的日常保健需求具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄精根茎、枸杞、陈皮、绿茶（60 ℃烘干后粉碎过40目筛备用），云南新世纪药业有限公司；凸圆灵芝（白芝）GIM5.6，广东省微生物菌种保藏中心；兔角膜上皮细胞（SIRC）人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC），华拓生物科技有限公司；胎牛血清，杭州四季青试剂公司；高糖DMEM培养基，美国Gibco公司；芦丁、没食子酸、双抗、胰蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司；抽线玉米纤维茶包袋，上海爱茶科技有限公司；所用其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；生化培养箱（LRH-250），上海医疗器械五厂；超净工作台（SW-CJ-2D），苏州净化设备有限公司；CO2培养箱，美国Thermo Fisher；倒置显微镜，日本Olympus；生物安全柜，苏州净化设备有限公司；酶标仪（INFINITE M200 PRO），瑞士TECAN；紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黄精袋泡茶的制备

1.3.1.1 黄精的发酵加工

取一定量干燥粉碎生黄精与辅料麸皮按质量比3∶1比例混匀后121 ℃灭菌20 min，接种10%凸圆灵芝液体种子，于28 ℃固态发酵12 d。发酵结束后于60 ℃干燥12 h即得发酵黄精样。1.3.1.2 黄精袋泡茶的复配

以发酵黄精为主要原料，按照适宜比例复配枸杞、陈皮、绿茶为辅料，混合均匀后分装入玉米纤维茶包袋，每袋含内容物4 g。

1.3.2 黄精袋泡茶的配方优化设计

试验以多糖、茶多酚、黄酮含量和感官评分为评价指标，采用试验设计软件Design Expert中混料设计D-Optional方法[11]对黄精袋泡茶的配方进行优化，确定发酵黄精、枸杞、陈皮和绿茶的最佳添加比例。设定黄精发酵产物在配方中所占百分比为50%～60%，其他各成分在配方中所占百分比为5%～20%进行试验。

1.3.3 黄精的刺激性评价

应用兔角膜上皮细胞（SIRC）短时暴露法评价黄精的刺激性[12-13]。选择对数生长期的SIRC细胞，按照105个/孔密度接种于96孔板，待细胞生长融合后，每孔添加受试物100 μL处理细胞5 min（每个样品做6个复孔），然后移除受试物并用PBS洗3次，在每孔中加入H-DMEM培养基100 μL和MTS溶液10 μL，置于37℃ CO2培养箱中培养3 h 左右，于490 nm测定吸光度，计算细胞存活率。其中，样品设置生黄精样和发酵黄精样作对比，样品前处理步骤为：分别取5 g干燥粉碎生黄精和发酵黄精，按照料水比1∶20（g/mL）用蒸馏水于95 ℃回流浸提，收集上清液，定容至500 mL。同时设置阳性对照为具有明确眼刺激性的十二烷基硫酸钠（SDS，5 mg/mL），阴性对照甘油（10 mg/mL）。

1.3.4 黄精抗氧化损伤活性评价

由于血管内皮细胞受损，发生功能障碍是出现动脉粥样硬化等心血管疾病的始动环节，因此，保护血管内皮细胞是预防相关疾病的关键[14]。参照文献[15]方法以黄精对过氧化氢氧化损伤的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的保护作用来评价其抗氧化损伤活性。其中，测试分组为：过氧化氢氧化损伤模型组：以完全培养液（89%高糖DMEM培养液+10%胎牛血清+1%双抗）将细胞继续培养24 h后加入H2O2溶液并使其在孔内终浓度为1.1 mmol/L（建模试验筛选浓度），诱导损伤4 h；黄精样品组：分别添加生黄精和发酵黄精处理液（分别取5 g干燥粉碎生黄精和发酵黄精，以蒸馏水于95 ℃回流浸提，收集上清液，定容至250 mL），调整样液在孔内浓度为原料质量浓度10 mg/mL，与细胞共同孵育24后，再以模型浓度加入H2O2诱导损伤4 h；正常对照组：用完全培养液继续培养细胞，每隔24 h换1次液。最后将各组以MTS法检测细胞存活率。

1.3.5 黄精袋泡茶的主要活性成分含量测定

多糖含量测定：以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法[16]测定多糖含量，绘制标准曲线（y=52.657x-0.040 4，R2=0.996 3）。取制备好的袋茶（4 g/袋），加入200 mL 90 ℃纯净水浸泡15 min。取100 mL茶汤加入无水乙醇使含醇量达80%，于4 ℃静置过夜，抽滤收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗后于40 ℃烘干得粗多糖，用蒸馏水溶解并定容至100 mL。按标准物质操作步骤进行样品测定，计算袋泡茶中多糖含量。

黄酮含量测定：以芦丁为标准品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[17]测定黄酮含量，绘制标准曲线（y=5.845x+0.002 7，R2=0.999 6）。取制备好的袋茶（4 g/袋），加入200 mL 90 ℃纯净水浸泡15 min。取50 mL茶汤以蒸馏水定容至100 mL，以3 500 r/min离心10 min，取上清液按标准物质操作步骤进行样品测定，计算袋泡茶中黄酮含量。

茶多酚含量测定：以没食子酸为标准品，按照GB/T 8313—2018测定茶多酚含量，绘制标准曲线（y=0.003 9x-0.012，R2=0.997 8）。同上处理袋茶得上清液按标准品操作步骤进行样品测定，计算袋泡茶中茶多酚含量。

1.3.6 黄精袋泡茶的感官评价黄精袋泡茶感官评分标准见表1。

表1 黄精袋泡茶感官评分标准

取制备好的袋泡茶以90 ℃蒸馏水浸泡15 min后，组织30名品评员分别从汤色、香气和滋味进行品评打分，满分为100分。感官评分标准参照GB/T 24690—2018《袋泡茶》制定，并结合产品特点作适当修改。

2 结果与分析

2.1 发酵对黄精刺激性和抗氧化损伤活性的影响

图1结果显示，生黄精相比于阴性对照甘油，表现出一定的刺激性，SIRC细胞经生黄精样处理后存活率为（68.55%±5.23%），但远低于阳性对照SDS（细胞存活率11.37%±3.75%）。黄精经凸圆灵芝发酵后，刺激性得到显著改善，表现为发酵样品处理SIRC细胞后存活率提高到90.60%±3.55%；麻味消失，以热水冲泡后还带有淡淡清香味，口感甘醇。发酵还能提高黄精抗氧化损伤活性，对比过氧化氢损伤模型组（细胞存活率54.66%±4.12%），HUVEC细胞经发酵黄精提前干预后存活率提高到78.13%±4.25%。从试验结果可以看出，发酵处理对黄精起到了减毒（刺激性）增效的作用，这可能是由于发酵带来的生物转化作用，使其中的关键成分如多糖、皂苷等物质的含量或是其结构等相关信息发生了变化，从而引起了刺激性和活性的转变[18]。因此，发酵加工对于改善生黄精口感和活性具有重要意义。

2.2 黄精袋泡茶配方模型的建立与分析

黄精袋泡茶的配方设计和试验结果见表2。以多糖含量、茶多酚含量、黄酮含量和感官评分作为响应值，应用Design Expert软件对表1的试验数据进行二次多项回归拟合，建立4个指标（Y多糖含量、Y茶多酚含量、Y黄酮含量、Y感官评分）的回归模型，得到各回归模型方程如下：

对模型方程进行方差分析，其中以茶多酚和黄酮含量为响应值的二次模型和线性模型均呈极显著水平（p＜0.01）。多糖含量、茶多酚含量、黄酮含量和感官评分4项指标的判定系数（R2）分别为0.914 6，0.908 7，0.886 2和0.925 0，表明试验结果与模型拟合程度良好。

图1 不同黄精样品的刺激性和抗氧化损伤活性

表2 黄精袋泡茶的配方设计和试验结果

2.3 配方各原料变化对活性成分含量和感官评分的影响

黄精袋茶的配方中共有4种成分，在等高线和二维曲面图中固定其中一种成分，可以比较其他3种成分交互作用对指标的影响。其中，图2～图4表示各辅料的添加量对茶汤中活性成分含量的影响。图2结果显示，配方组成中适当控制黄精的添加量，提高枸杞和陈皮的添加比例更有利于增加茶汤中多糖的溶出量。枸杞中含有丰富的枸杞多糖，含量超过50%[19]，因此其是复合袋茶中最主要的多糖贡献组分。图3结果显示，响应曲面随着绿茶添加量增加的方向显著往上倾斜，说明绿茶添加量对茶汤中茶多酚含量影响较强，在各原料中占主导地位，这与绿茶中含有丰富的茶多酚有关。图4显示黄酮含量随着陈皮添加量的增加，有较为明显的增幅。陈皮本身含丰富的黄酮类化合物如芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素等，增加其在配方中的比例会使茶汤中的黄酮含量相应增高。

图2 发酵黄精、枸杞、陈皮的交互作用对产品多糖含量影响的等高线和响应曲面

图3 枸杞、陈皮、绿茶的交互作用对产品茶多酚含量影响的等高线和响应曲面

图5 表示各辅料添加量对茶汤感官评分的影响。结果显示，随着发酵黄精的添加量增加，感官评分明显随之增高；不断提高辅料绿茶的添加量，感官评分降低；当陈皮添加量在5%～15%左右，感官评分随添加量增加而提高，但添加量超过15%水平再进一步提高，感官评分反而下降。黄精发酵后麻味消失，冲泡后茶汤中还带有淡淡清香味，口感甘醇，增加发酵黄精的添加量对香气和滋味有较好的提升作用。但由于复配的陈皮和枸杞均具有较强的特殊风味，因此考虑复配后茶汤的混合口感，发酵黄精添加量也不宜过多。由于绿茶和陈皮泡水后带有轻微的苦涩味，随着添加量增加茶汤的涩味加重，感官评分有所降低，因此需控制其添加量，但陈皮由于还赋予茶汤特有的果香味，可以在适宜的比例（5%～15%）内适当提高其用量。

图4 发酵黄精、枸杞、陈皮的交互作用对产品黄酮含量影响的等高线和响应曲面

图5 发酵黄精、绿茶、陈皮的交互作用对产品感官品质影响的等高线和响应曲面

2.4 袋泡茶最优配方的确定

袋泡茶配方的确定优先考虑其保健功能，因此，在制备过程以最大程度获得活性物质（多糖、茶多酚和黄酮含量）为基础，并尽可能使产品有良好的感官品质。基于此目标对各指标进行权重系数确定，多糖、茶多酚和黄酮含量的权重系数均为0.3，感官指标权重系数为0.1，运用隶属度综合评分法[20]和赋予的权重进行加权求和得到各样本的综合评分见表3。其中隶属度按公式计算：L=（Ci-Cmin）/（Cmax-Cmin）。式中，Ci为指标值；Cmin为指标最小值；Cmax为指标最大值。以各项指标的综合评分作为目标参数，利用Design Expert软件对综合评分结进行二次多项回归拟合，建立Y综合评分的回归模型，回归模型方程如下：

对模型方程进行方差分析，结果见表4。黄精袋泡茶配方的二次模型达到显著水平（p＜0.05），线性混合模型达到极显著水平（p＜0.01），配方综合评分的判定系数R2=0.916 0，说明模型拟合程度较好，能较好地表现考察指标和复配比例之间的关系，因此可以用该模型对袋泡茶的最优配方进行分析和预测。

表3 黄精袋泡茶各指标的隶属度和综合评分

表4 黄精袋泡茶综合评分的二次多项回归模型方差分析

应用软件的最优化功能得到黄精袋泡茶配方的最优组合为：发酵黄精50.00%、枸杞11.59%、陈皮18.66%、绿茶19.75%。在此点预测所得茶包的综合评分0.902 1，根据优化后的配方进行验证试验，得到袋泡茶的各项指标值为多糖含量545.23 mg/g，茶多酚含量603.34 mg/g，黄酮含量38.78 mg/g，感官评分83.40分，综合评分0.887 2分，与预测值基本接近，说明混料设计法在黄精袋泡茶配方设计和优化中的应用有效。

3 结论

试验应用发酵法对黄精预加工，经凸圆灵芝固态发酵后，黄精的刺激性得到有效改善，对HUVEC人脐静脉血管内皮细胞氧化损伤的保护作用显著提高，可用于保护心血管的功能性食品开发。应用混料设计法研究了黄精袋泡茶的最优配方，得到各原料添加的最优比例：发酵黄精50.00%、枸杞11.59%、陈皮18.66%、绿茶19.75%。此配方下所得袋泡茶各项指标值为多糖含量545.23 mg/g，茶多酚含量603.34 mg/g，黄酮含量38.78 mg/g，感官评分83.40分。冲泡后茶汤金黄清透，带有淡淡清香味，口感醇正，回味甘甜。