范海茹，李京，许斌，李淑英*，王凤忠*

1. 中国农业科学院农产品加工研究所（北京 100193）；2. 河南牧业经济学院食品与生物工程学院（郑州 450046）

我国是重要的大豆消费国，我国的大豆年消费量约1.1亿 t，位居世界首位[1]。豆粕是提取豆油后得到的一种副产品，提油后经低温或闪蒸脱溶处理得到低温豆粕，其蛋白质变性程度较小，常用来加工大豆蛋白制品，但是生产时对设备要求较高，且产量较少；工业生产中主要以高温豆粕为主，高温豆粕经高温脱溶后而得，约占豆粕产量的95%[2]，由于其蛋白质高度变性，大约85%的豆粕被用于动物饲养，在食品上应用极少[3-4]。豆粕含有大豆中全部蛋白质，且用途较广，具有极高的开发价值和利用价值[5]。

目前蛋白质改性方法主要有化学法[6]、物理法[7]及酶解法[8]。酶解法更安全高效，作用条件温和，显著改善豆粕品质，破坏或消除豆粕的抗营养因子，且将豆粕中蛋白质酶解为多肽和氨基酸，不仅提升生物效价，还赋予酶解产物更多生物活性[10]，工业上应用较广[9]。

豆粕酶解制备小分子肽的研究多在豆粕的复合酶解与生物活性肽制备等方面[11]，也有报道利用酶解豆粕制备呈味肽的研究，但多数成果仅停留在实验室阶段[12-13]。我国调味品市场中，含肽调味品发展迅速，需求量与日俱增。现已发展至第四代鲜味调味料，即营养型鲜味调味料，该类调味料因加入植物类蛋白酶水解产物等物质，具有一定营养价值，可补充人体必需氨基酸、小分子肽和微量元素等[14]。目前针对肽研究还存在一定问题，包括肽来源种类较少，肽资源尚待进一步开发等[15]。豆粕中粗蛋白含量高，营养丰富均衡、氨基酸组成合理，是制备呈味肽的优质蛋白原料，因此豆粕蛋白的高值化利用具有潜在的研究价值[12]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高温豆粕（市售）；碱性蛋白酶（200 000 U/g，北京索莱宝科技有限公司）；中性蛋白酶（50 000 U/g，北京索莱宝科技有限公司）；木瓜蛋白酶（100 000 U/g，北京索莱宝科技有限公司）；胰蛋白酶（＞250 N.F.U/mg，北京索莱宝科技有限公司）；菠萝蛋白酶（600 U/mg，北京索莱宝科技有限公司）；NaOH、HCl（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

METTLER TOLEDO Five Easy Plus型pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FA2004型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；FW 100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；UDK 159型全自动凯氏定氮仪（意大利VELP）；RH-QA型恒温摇床（常州中诚仪器制造有限公司）；3K15型医用离心机（SIGMA）；G136T型灭菌锅（AUTOCLAVE）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

取适量高温豆粕原料，用粉碎机粉碎后，过80目筛，备用。

1.2.2 酶解工艺

参考余敏[16]的方法略作修改：以高温豆粕粉为原料，配制成8%豆粕悬浊液，于121 ℃灭菌15 min，冷却至室温，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液调节豆粕悬浊液至蛋白酶最适pH，加入适量蛋白酶后放入摇床，振荡，防止豆粕样品产生聚沉，温度保持蛋白酶最适酶解温度，利用1 mol/L NaOH溶液调节酶解体系使pH保持不变，酶解一定时间后，取出酶解液，沸水浴10 min灭酶。以8 000 r/min离心15 min，取上清液，即为豆粕酶解液，冻干后-20 ℃冷冻备用。

1.2.3 蛋白酶的筛选

选择木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，分别酶解8%豆粕液。不同蛋白酶反应条件不同，选用：木瓜蛋白酶酶解温度50℃，加酶量25 000 U/g，pH 6.35；中性蛋白酶酶解温度50 ℃，加酶量6 000 U/g，pH 6.35；碱性蛋白酶酶解温度50 ℃，加酶量4 000 U/g，pH 9；菠萝蛋白酶酶解温度45 ℃，加酶量30 000 U/g，pH 6.35；胰蛋白酶酶解温度37 ℃，加酶量31 250 U/g，pH 8。分别酶解12 h，以酶解产物的水解度和滋味稀释因子为指标，筛选出最佳内切蛋白酶。

1.2.4 单因素试验

配制8%豆粕悬浊液，最佳内切酶为水解酶，以加酶量、水解时间、水解pH为单因素进行单因素试验，测定水解度和滋味稀释因子。

1.2.5 正交试验

根据单因素试验结果，确定正交试验中各因素范围，选择L9(34)正交表，以水解度为指标，对加酶量、水解时间、水解pH进行正交优化，因素水平表见表1，试验重复3次。

表1 中性蛋白酶正交试验因素水平表

1.2.6 总蛋白含量测定

参考GB 5009.5—2016[17]对蛋白质含量测定方法，取1 g高温豆粕粉进行消化，使用全自动凯氏定氮仪测定总蛋白含量。

1.2.7 水解度（Degree of hydrolysis，DH）的测定

参考Liu等[18]和余敏[16]的方法，采用pH-Stat法，在高温豆粕粉酶解过程中，利用1 mol/L NaOH溶液调节酶解体系使pH保持不变，记录消耗的NaOH溶液体积，以计算水解度。

式中：B表示酶解过程中消耗NaOH溶液的体积，mL；Nb表示NaOH溶液的浓度，mol/L；α表示氨基的解离度，α=10(pH-pK)/[1+10(pH-pK)]，试验pK=7；Mp表示底物蛋白质含量，g；htot表示每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数，豆粕htot=8.38。

1.2.8 滋味稀释分析（Taste dilution analysis，TD）

参考Liu等[18]和Seo等[19]的方法，采用比较滋味稀释分析对高温豆粕蛋白酶解产物进行苦味稀释因子测定，每个样品的TD值采用各个感官评价员评定结果的平均值，各个感官评价员评定结果之间的差异≤一个稀释水平。

1.3 数据处理

试验数据以平均数±标准差（x±s）表示，用Graphpad Prism 7软件作图，采用Design Expert 8.0.6软件进行方差分析。

2 试验结果

2.1 高温豆粕的蛋白质含量

通过凯氏定氮法测定，高温豆粕中的蛋白质含量为40.41%。

2.2 蛋白酶的筛选

图1 不同酶解时间下豆粕蛋白酶解产物的水解度和TD值的变化

如图1所示，5种酶解产物水解度由高到低依次为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶。在酶解过程中，水解度逐渐升高，同时多肽及氨基酸大量产生。TD值也显示出上升趋势，说明多肽产生的苦味在苦味感官上起主要作用。碱性蛋白酶的苦味值远高于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶水解度低于中性蛋白酶。因此，为得到低苦味且酶解效果好的产物，选择中性蛋白酶进行后续试验。

2.3 中性蛋白酶酶解高温豆粕工艺条件

2.3.1 单因素试验优化中性蛋白酶最佳酶解条件

在温度50 ℃、加酶量6 000 U/g、酶解时间3 h条件下，探究pH对水解度的影响。由图2（A）可知，当pH 5.5时得最大水解度，pH 6时水解度（24.86%）略低于pH 5.5，但无明显差异，且为减少酶解过程中资源浪费，故选择pH 5.8，6和6.2作为正交试验中考察的pH参数水平。

在温度50 ℃、加酶量6 000 U/g、pH 6.35的酶解条件下，测定不同时间的水解度和TD值。如图2（B）所示，TD值在2 h后无变化，5 h后水解度（23.55%）逐渐稳定。故选择酶解时间4.5，5和5.5 h作为正交试验的时间参数水平。

在温度50 ℃、pH 6.35条件下酶解3 h，分别取样品测水解度和TD值。由图2（C）可知，随加酶量逐渐增加，加酶量达3 000 U/g后，TD值不再升高，水解度也随加酶量增加而逐渐平稳。故选择中性蛋白酶加酶量4 500，6 000和7 500 U/g为正交试验中加酶量的参数水平。

图2 单因素试验优化中性蛋白酶最佳酶解条件

2.3.2 正交试验优化中性蛋白酶最佳酶解条件

在单因素试验的基础上，以加酶量、pH和时间为因素，参考L9(34)正交试验因素水平表设计三因素三水平正交优化试验（表1），以水解度为考察指标，确定中性蛋白酶酶解高温豆粕的工艺条件。由表2可知，三个指标的影响顺序为B＞A＞C；最优酶解组合为A3B1C2，即加酶量7 500 U/g，pH 5.8，酶解时间5 h。对此组合可靠性进行验证，按照此条件对高温豆粕酶解，水解度为31.16%，高于表2中任何一组。

表2 中性蛋白酶酶解正交试验结果

3 讨论

在相同的酶解条件下，不同蛋白酶对蛋白质酶解效果不同，主要是酶具有专一性，每种酶只能作用于某些特定的位点，所以即使是同样的底物，不同酶的水解效果会有所不同[20]。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶均属于内切酶，因为作用位点各异，对高温豆粕的水解效果不一，产生的多肽氨基酸组成、游离氨基酸含量等不同，导致酶解产物的苦味值也不同。

酶解pH、酶解时间和蛋白酶添加量均会影响酶解产物的水解度。其中，pH对酶解反应影响的原因有很多。刘淳等[21]研究表明，酶的活性与酶解环境的酸碱程度有关，过酸或过碱时，酶会发生可逆或不可逆失活，并且pH可改变底物及酶的结合状态，影响二者作用效果，从而降低酶的活性。宁芯等[22]也有相似的结论，即调节pH会引起溶液中H+浓度的变化，可以影响蛋白酶自身的解离和底物的解离，从而影响酶与底物蛋白的结合与催化。李俊江等[23]研究也表示，pH影响酶的稳定性，在调节pH的过程中，其对蛋白酶的空间构象与催化相关基团的解离状态、酶和底物的结合和解离会有不同程度的影响，从而影响酶解反应。增加蛋白酶用量，可促进酶与底物之间的结合，但在酶解反应中，酶用量并不是越多越好。当底物浓度不变时，增加蛋白酶用量，酶量会由少至多，甚至过剩，则单位时间内存在部分酶无法与底物结合，使水解效果增幅变缓[24]。另外，酶作为一种蛋白，极有可能在酶解过程中发生酶解反应，用量过度会干扰酶解物构成[25]。在酶解反应过程中，水解度大都先快速增加，后增速变缓，可能是随该反应时间延长，蛋白酶活逐渐下降，导致酶解速率减缓；另外一个原因是豆粕中包含了可溶性蛋白和不溶性蛋白，可溶性蛋白中敏感性肽键会在早期阶段与蛋白酶快速作用并断裂，而不敏感肽键断裂迟缓；不溶性蛋白的酶解过程中，酶分子吸附在其表面，首先酶切较稀疏的多肽链，然后再缓慢水解中心的肽键[26]。

4 结论

以高温豆粕为原料，以水解度和滋味稀释因子为指标，比较了内切酶（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶）的酶解效果，筛选出最佳内切酶，为中性蛋白酶；并通过单因素试验考察了中性蛋白酶添加量、酶解pH和酶解时间3个因素对豆粕蛋白水解度和苦味TD值的影响，在此基础上，通过L9(34)正交试验优化了酶解高温豆粕的酶解工艺，即中性蛋白酶添加量7 500 U/g、pH 5.8、酶解时间5 h。在此条件下水解度为31.16%。此次试验为高温豆粕高值化利用奠定理论基础。