林海蛟，张继福，张 云，胡云峰

(1.中国科学院 南海海洋研究所，广东 广州 510301；2.中国科学院 热带海洋生物资源与生态重点实验室(中国科学院 南海海洋研究所)，广东 广州 510301；3.南方海洋科学与工程广东省实验室(广州)，广东 广州 511458；4.广东省中医院，广东 广州 510120)

脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)属于羧基酯水解酶，能够逐步将甘油三脂水解成甘油和脂肪酸，并能够催化酯化和转酯化等重要化学反应[1-3]，在工业上应用广泛。但是游离的脂肪酶存在着稳定性低、对环境敏感和使用过程不能回收重复利用等诸多缺陷[4-5]。为了解决这些问题，酶的固定化技术被提出。

常见的酶固定化方法有吸附法、交联法、包埋法和共价结合法[6]。这4种固定化方法各有其优缺点。吸附法利用载体和酶分子之间产生的弱作用力相互吸引而联结在一起，但是弱作用力的结合不够牢固，在反应过程中酶分子容易脱落[7-8]。交联法指的是利用双功能或多功能试剂，使试剂与酶分子、酶分子之间或者试剂与载体形成共价键从而将酶分子固定起来[9]，交联反应所形成的共价键比较稳定，但是交联过程又容易造成酶活力损失。包埋法是利用高分子聚合物将酶包裹起来的一种方法[10]，包埋过程对酶损害小，但该法制备的固定化酶作用力通常不强[11]。共价结合法是酶分子与载体以共价键结合在一起的一种方法，该法制备的固定化酶稳定性好，但是对酶要求苛刻，容易造成酶蛋白结构改变[9]。因此，在实际应用中，经常是多种固定化方法结合使用。比如林海蛟等[4]以硅藻土为载体，通过吸附法和交联法联合固定化海洋来源脂肪酶，所制备固定化酶的酶活力为124.83 U/g，酶活力回收率为67.31%；童晓倩等[12]通过包埋法和交联法固定化风味酶，酶活力回收率为80.05%。

在吸附法和交联法的结合应用过程中，科研人员认为交联过程的反应较为激烈，容易造成酶活力失活[13]，因此通常选择把交联法放在吸附法之后，以减少交联对酶的损害。但是吸附-交联法降低了交联程度，导致所制备的固定化酶在反应过程中酶分子容易脱落。目前，先交联后吸附法固定化生物酶的相关报道较少，本实验室[14]曾对基于无机载体硅藻土的先交联后吸附的固定化方法进行探究，所制备固定化脂肪酶的酶活力为113.29 U/g，酶活力回收率为72.89%。该固定化酶比游离脂肪酶具有更好的温度稳定性、pH稳定性和良好的储存稳定性，在4 ℃保存60 d依然保持87%以上的酶活力；连续操作5次依然保持60%以上的酶活性。先交联后吸附固定化脂肪酶的工艺研究仍值得进一步探究。

大孔吸附树脂是一种不含交换基团、具有大孔结构的有机高聚物吸附剂，与硅藻土和蒙脱土等无机材料类似，也是利用弱作用力吸附酶分子[15]。同时，大孔吸附树脂具有网状结构和比较大的比表面积[16]，而且稳定性好[17]。为了进一步验证先交联后吸附固定化法，本实验以大孔吸附树脂为载体进行系统固定化探究，通过先交联后吸附法固定化海洋来源脂肪酶。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：海洋(假丝酵母)脂肪酶(上海鼓臣生物有限公司)；大孔吸附树脂(郑州和成新材料科技有限公司)；聚乙烯醇PVA(天津市大茂化学试剂厂)；无水乙醇、异辛烷(天津市津东天正精细化学试剂厂)；新戊二醇二缩水甘油醚、橄榄油(上海麦克林生化科技有限公司)。

仪器：PB-10酸度计(德国Sartorus公司)；Allegra X-30R Centrifuge型离心机(Beckman公司, Coulter)；移液枪(吉尔森公司)；DJS-2012R型恒温摇床(上海实维实验仪器技术有限公司)；涡旋振荡器(Tomos)；DK-8D水浴锅、电热鼓风箱(上海一恒科学仪器有限公司)；SCIENTZ-IID 型超声破碎仪、超声清洗仪(宁波新芝生物公司)。

1.2 酶活力的测定

1.2.1 脂肪酶活力的测定

酶活力的测定：游离酶的酶活力测定采用改进铜皂分光光度法[18]。固定化酶的酶活力测定方法与游离酶的测定相同，只需将游离酶换成适量的固定化酶[19]。

酶活力定义：在测定条件下(40 ℃，pH7.0)，每分钟催化1 μmol底物转化为脂肪酸所需的酶量为1个活力单位(U)[13]。

相对酶活力：在同一组实验中，设定酶活力最高的一组为100%，其余组别的酶活力与之相比，用百分比表示[19]。

1.2.2 固定化酶活力回收率[19-22]

酶活力回收率的计算公式如式(1)。

(1)

1.3 脂肪酶交联实验[14,23]

将海洋脂肪酶溶解于pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，配制成酶液浓度为2 g/mL，再将酶液4 ℃冷冻离心，取10 mL酶液上清液置于50 mL塑料管中，加入50 μL新戊二醇二缩水甘油醚交联剂，35 ℃摇床交联2 h。

1.4 脂肪酶吸附实验

1.4.1 载体的筛选

在交联结束后，考察载体类型对脂肪酶吸附实验的影响，分别称取一定量DA-201、X-5、101D、H103、NKA-2、NKA-9、AB-8、GDX-104和HPD700等9种大孔吸附树脂载体加入装有酶液的塑料管中，在适当温度的恒温摇床里吸附一定时间，将固定化酶取出，抽滤，37 ℃烘干，测定酶活力。

1.4.2 载体量优化

固定其他条件不变，考察载体量对脂肪酶吸附实验的影响，分别加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g的HPD700大孔吸附树脂，在适当温度恒温摇床中吸附一定时间，吸附结束后抽滤、烘干，测定酶活力。

1.4.3 吸附温度优化

固定其他条件不变，考察温度对脂肪酶吸附实验的影响，称取1.0 g的HPD700大孔吸附树脂加入塑料管中，分别放在25、30、35、40、45、50、55 ℃的摇床中吸附一定时间，吸附结束后取出抽滤、烘干，测定酶活力。

1.4.4 吸附时间优化

固定其他条件不变，考察吸附时间对脂肪酶吸附实验的影响，称取1.0 g的HPD700大孔吸附树脂加入塑料管中，分别吸附1、2、4、6、8 h后抽滤、烘干，测定酶活力。

1.4.5 吸附正交试验

在单因素试验基础上，选择对吸附影响较大的水平和因素，设计3水平3因素正交试验。考察指标为相对酶活力，正交试验设计如表1。

表1 吸附正交试验因素与水平

1.5 固定化酶的酶学性质鉴定

1.5.1 最适反应pH

将0.05 mol/L磷酸钠缓冲液配制成pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的酸碱梯度，在40 ℃摇床中测固定化酶和游离酶的酶活力。根据所测的酶活力分别绘制固定化酶和游离酶相对酶活力，比较两者的最适反应pH。

1.5.2 pH耐受性

分别将固定化酶和游离酶放置在pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的环境中3 h，保持两者其他处理条件一致，3 h后将固定化酶和游离酶取出，测定酶活力。根据酶活力绘制两者相对酶活力曲线，比较两者对酸碱环境的耐受性。

1.5.3 最适反应温度

将固定化酶和游离酶分别在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃的摇床中测酶活力，根据所测的酶活力分别绘制固定化酶和游离酶相对酶活力，比较两者的最适反应温度。

1.5.4 热耐受性

将固定化酶和游离酶分别在30、40、50、60、70 ℃的环境中放置3 h，保持两者其他处理条件一致，3 h后将固定化酶和游离酶取出并测定酶活力。根据酶活力绘制两者相对酶活力曲线，比较两者对热的耐受性。

1.5.5 操作稳定性

将制备好的固定化酶抽滤、烘干，称取0.1 g，在40 ℃、pH7.0下连续反应5次，以第一次反应的酶活力为100%，探究该固定化酶的操作稳定性。

1.5.6 储存稳定性

制备一定量的固定化酶并将其储存于4 ℃冰箱，每隔一定时间取出适量，测定其酶活力，以第一次所测酶活力为100%，一直测到储存60 d，探究固定化酶的储存稳定性。

2 结果与分析

2.1 吸附实验结果

2.1.1 吸附载体的筛选

9种大孔吸附树脂筛选结果如图1(a)所示。结果表明：大孔吸附树脂HPD700的吸附效果最好。HPD700是非极性大孔吸附树脂，其比表面积650～700 m2/g、平均孔径8.5～9.0 nm[15]。HPD700比表面积比较大，能够吸附更多的酶分子；其平均孔径介于其他大孔吸附树脂之间，有可能刚好与交联后的脂肪酶体积相匹配，既不会因为孔径太小导致酶吸附量少，又避免孔径过大导致吸附不牢固。本实验优选大孔吸附树脂HPD700为后续固定化实验的载体。

2.1.2 吸附载体量优化

吸附载体量优化结果如图1(b)所示。结果表明：最适载体量为0.5 g，相对酶活力随着载体量增加而降低。可能原因是在相同酶量的反应体系中，随着载体量增加单位体积的载体所吸附的酶量变少，酶活力降低。因此选择1.0 g作为后续载体的量。

2.1.3 吸附温度优化

吸附温度优化结果如图1(c)所示。结果表明：随着吸附温度逐渐升高，相对酶活力也逐渐升高，在45 ℃时达到最高，之后随着温度升高相对酶活力开始下降。这可能是因为温度逐渐升高时，酶分子的热运动也逐渐变快[24]，吸附速度加快，吸附量增加；但是过高的温度会使酶分子从载体上脱落，甚至使酶蛋白质变性。所以当温度升高到45 ℃之后，酶活力下降。因此选择45 ℃作为后续实验温度。

2.1.4 吸附时间优化

吸附时间优化结果如图1(d)所示。结果表明：在吸附1 h时相对酶活力达到最高，之后随吸附时间延长酶活力下降。可能原因是在吸附1 h后，大孔吸附树脂HPD700已经吸附酶分子饱和，之后随着吸附继续进行，载体孔隙堵塞，造成酶促反应时酶分子不能充分展开。

注：1.平行实验个数为3，所得数据为3个平行实验均值，误差计算方法是计算3个平行实验的标准差。

2.1.5 吸附正交试验结果

吸附正交试验结果如表2所示。对正交试验结果进行方差分析，5%显著水平，温度FA=9.025，载体量FB=12.172，时间FC=1.406，三者都小于Ftab=19.000，因此3个因素对相对酶活力影响都不显著。依据极差分析结果，主次影响因素由大到小依次为：载体量、温度、时间，最适吸附条件为：温度40 ℃、载体量1.0 g、时间2 h，在该条件下所测酶活力为190.80 U/g，酶活力回收率为43.04%。

表2 吸附正交试验结果与分析

2.2 酶学性质鉴定结果

2.2.1 最适反应pH

固定化酶和游离酶最适反应pH结果如图2(a)所示。结果表明：在pH5.0～8.5，固定化酶与游离酶的相对酶活力变化趋势基本一致，最适反应pH都是8.0。但是在pH 5.0时固定化酶的相对酶活力比游离酶高。

2.2.2 pH耐受性

固定化酶和游离酶pH耐受性结果如图2(b)所示。结果表明：在pH5～6和pH8～9下放置3 h，固定化酶的稳定性比游离酶略低；但是在pH7.0，固定化酶的酶活明显高于游离酶。这可能是因为大孔吸附树脂HPD700具有较大的比表面积，酶分子被吸附后在酸和碱环境中暴露的面积也比游离酶大，因此更容易受到外界pH影响；但是在pH7.0，固定化酶明显比游离酶具有更好的pH耐受性。

2.2.3 最适反应温度

固定化酶和游离酶的最适反应温度如图2(c)所示。结果表明：游离酶最适反应温度为45 ℃，固定化酶的最适反应温度为60 ℃，比游离酶提高15 ℃。由此可见，本实验制备的固定化酶比游离酶最适反应温度大幅度提高。

2.2.4 热耐受性

固定化酶和游离酶的热耐受性结果如图2(d)所示。结果表明：在30～40 ℃，固定化酶的相对酶活力低于游离酶，但固定化酶在50～70 ℃，温度稳定性明显高于游离酶。这可能是因为游离酶暴露在高于50 ℃的高温条件下，酶蛋白结构受热发生改变；而固定化酶在固定化载体的保护下一定程度上减弱高温环境的损害，因此温度稳定性比游离酶好。而且，游离酶在温度超过60 ℃后，酶活力急剧下降，在70 ℃时只剩余25.60%，而固定化酶在70 ℃时还能保留约60%的酶活力。因此进一步说明固定化酶的热稳定性明显优于游离酶。

2.2.5 操作稳定性

固定化酶的操作稳定性结果如图2(e)所示。结果表明：固定化脂肪酶连续反应操作5次后仍保留57.38%的酶活力，相比于游离酶只能操作1次，固定化酶的操作稳定性比游离酶大幅度提高。

2.2.6 储存稳定性

固定化脂肪酶储存稳定性结果如图2(f)所示。结果表明：随着保存时间延长酶活力慢慢下降，在第14天时剩余77.82%的酶活力，第60天剩余69.40%酶活力。且从第5天到第60天，固定化酶的酶活力基本保持不变，可见该方法所制备固定化酶储存稳定性较好。

注：1.平行实验个数为3，所得数据为3个平行实验均值。误差计算方法是计算3个平行实验的标准差。

3 讨论

本研究是为了进一步验证先交联后吸附法固定化脂肪酶的可行性和适用性。本实验室之前以无机材料硅藻土为载体，使用先交联后吸附法制备固定化脂肪酶的酶活力为113.29 U/g，酶活力回收率为72.89%[14]。对比先前的实验，本工作以有机材料大孔吸附树脂HPD700为载体，通过先交联后吸附法制备的固定化酶的酶活力为190.80 U/g，酶活力回收率为43.04%。虽然酶活力回收率没有之前结果高，但是固定化酶的酶活力比之前提高了68.41%。可见，利用先交联后吸附法固定化脂肪酶工艺的效果较好并具有可行性。

目前对于先交联后吸附法固定化脂肪酶的研究比较少，大多数以先吸附后交联法为主。比如：姜峻颖等[25]采用MI-BSI伯胺功能基吸附树脂载体和京尼平交联剂，通过吸附-交联法固定化海洋脂肪酶YS2071；赵康等[26]以树脂为载体，京尼平为交联剂，采用吸附-交联法制备了固定化脂肪酶；Cao等[27]利用聚乙烯亚胺(PEI)制备的磁性微球载体吸附脂肪酶，再以戊二醛作为交联剂进一步将被微球吸附的脂肪酶与PEI交联，从而制备固定化脂肪酶。以上这些研究都是采取吸附-交联的固定化方法，但是先吸附后交联法降低了交联程度，所制备的固定化酶在反应过程中酶分子容易脱落。本实验使用的先交联后吸附法固定化脂肪酶，所得固定化结果要优于先前的一些先吸附后交联固定化方法。比如：本实验室以硅藻土为载体，先吸附后交联固定化海洋来源脂肪酶，所制备固定化酶的酶活力124.83 U/g[4]；钱明华等[17, 28]以大孔吸附树脂HPD 750为载体，所制备固定化酶的酶活回收率32.16%，低于本研究的43.04%。由此可见，先交联后吸附法可以作为一种可行的固定化方法进行工业酶的固定化，在工业酶的固定化制剂研究中具有较好的开发前景。

4 结论

本研究采用先交联后吸附法固定化海洋来源脂肪酶。交联实验以新型双环氧试剂新戊二醇二缩水甘油醚为交联剂，在本实验室之前优化的最优条件(交联pH5.5，温度35 ℃，质量分数0.5%，时间2 h)[14]下进行，交联结束后加入筛选得到的大孔吸附树脂HPD700进行吸附优化实验。通过单因素试验和正交试验确定了最佳吸附固定化条件为：温度40 ℃、载体量1.0 g、吸附时间2 h。在此工艺条件下所制备固定化脂肪酶的酶活力为190.80 U/g，酶活力回收率为43.04%。

对游离酶和所制备的固定化酶进行酶学性质鉴定，固定化酶和游离酶的最适反应pH都是8.0，但pH5.0～6.0时固定化酶的酶活力比游离酶高。在固定化酶的pH耐受性实验中，发现固定化酶在pH6.0～8.0的稳定性比游离酶好，在pH7.0时固定化酶的酶活明显高于游离酶。固定化酶的最适反应温度为60 ℃，比游离酶最适反应温度提高15 ℃。热耐受性实验显示游离酶放置在温度越高的环境中酶活力下降越快，特别是在温度超过60 ℃后酶活力急剧下降，在70 ℃时仅剩下25.60%酶活力；而固定化酶对热环境的耐受性很好，在30～50 ℃的环境酶活力不下降反而上升，在50～70 ℃，热稳定性明显高于游离酶，在温度超过60 ℃后酶活力下降缓慢，70 ℃时依然剩余59.66%酶活力。固定化酶的操作稳定性显示，所制备的固定化酶连续操作5次后剩余57.38%酶活力，操作稳定性得到很大提升。固定化酶的储存稳定性实验显示，在4 ℃冰箱保存60 d时剩余69.40%酶活力，可见该方法制备的固定化酶具有较好的储存稳定性。