王涛，汪凯，李亚强，胡盼盼，张梅，余传庆，薛敏

(1.安徽医科大学第一附属医院神经内科，合肥 230022；2.安徽省淮南市第一人民医院神经内科、安徽理工大学第一附属医院神经内科，淮南 232007)

在脑组织缺血-再灌注过程中，氧化应激反应过程和细胞凋亡过程过度激活是造成缺血-再灌注损伤的关键[1-2]，抑制氧化应激和细胞凋亡是减轻缺血-再灌损伤、改善再灌注治疗效果的重要靶点。白藜芦醇(resveratrol，Res)是广泛存在于葡萄、花生等天然植物中的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等广泛的生物学活性，对心脑血管系统具有确切保护效应[3]。国内研究报道，Res能够减轻神经元缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤，但关于细胞凋亡情况及氧化应激反应程度尚不明确[4]。笔者在本实验以神经元H/R模型模拟脑组织缺血-再灌注过程，以了解Res对神经元H/R过程中细胞凋亡、氧化应激反应的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 Res(购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：111535-201703)，PC12细胞株购于中国科学院细胞库(货号：C161832)，达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM)培养基、胎牛血清、神经生长因子购买于Gibco公司(批号分别为1912，0418A，180221C)，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5 -(3-羧甲酯基)-2 -(4 -磺苯基)-2H-四唑[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS]细胞活力检测试剂盒购于Promega公司(批号：YK180612131)，2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)活性氧检测试剂盒购于上海碧云天公司(批号：BYT18110217A)，放射免疫沉淀试剂盒购买于南京建成公司(批号：18110415A)，RNA提取、cDNA合成、荧光定量PCR试剂盒购买于北京天根公司(批号分别为18051922，18102913，18112109)；丙二醛酶联免疫试剂盒、人晚期氧化蛋白产物检测试剂盒、人8-羟基脱氧鸟苷酸(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)检测试剂盒均购自深圳晶美生物科技有限公司(货号分别为CEA597Ge，BYS11062B，xy-E10798)。

1.2实验方法

1.2.1细胞的培养和处理 PC12细胞复苏后用含10%胎牛血清、50 ng·mL-1神经生长因子的DMEM培养基培养，诱导PC12细胞向神经元分化。镜下观察到细胞长出长突起，即认为诱导分化成功，然后进行消化传代。传代后的细胞接种在培养板中，并分为对照组、H/R组和不同浓度(40，80 μmol·L-1)Res组。分别按照下列方法处理：对照组用无血清DMEM培养基在常氧培养箱[37 ℃、5%二氧化碳(CO2)]培养，H/R组用无血清DMEM培养基在缺氧培养箱[37 ℃、5%CO2、95%氮气(N2)]中缺氧培养2 h后在常氧培养箱(37 ℃、5%CO2)中继续培养；不同浓度Res组参照文献[4]研究结果，分别给予40和80 μmol·L-1Res处理，无血清DMEM培养基在缺氧培养箱(37 ℃、5%CO2、95%N2)中缺氧培养2 h后，在常氧培养箱(37 ℃、5%CO2)中继续培养。

1.2.2细胞活力的检测 复氧后12，24，48 h，向培养基中加入MTS试剂盒检测液，继续在培养基中孵育4 h，然后取出培养板，并在酶标仪上测定450 nm波长处吸光度值(A值)，细胞增殖活力值=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值。

1.2.3细胞中氧化应激产物的检测 复氧后48 h，弃去培养基并保留细胞，加入蛋白裂解液后充分裂解细胞，提取蛋白质，再采用DCFH-DA活性氧检测试剂盒测定活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量。采用丙二醛酶联免疫试剂盒、人晚期氧化蛋白产物检测试剂盒、人8-OHdG检测试剂盒分别对丙二醛(MDA)、晚期氧化蛋白产物(human advanced oxidation protein products，AOPP)、8-OHdG含量进行测定，均采用酶联免疫吸附测定法。

1.2.4细胞中基因mRNA表达量的检测 复氧后48 h，弃去培养基并保留细胞，加入Trizol裂解液后充分裂解，再采用RNA提取试剂盒和cDNA第一链合成试剂盒分离细胞中总RNA并反转录为cDNA；取cDNA样本，使用荧光定量PCR试剂盒扩增Bcl-2、Bax、Caspase-3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，引物序列为aattggtacc atttggatgc caacaccgat cattgggcgt ttgttgatca attgcacgcc，根据扩增曲线读取循环阈值，以GAPDH为内参计算Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达量。

1.2.5细胞中蛋白表达的免疫组化染色 复氧后48 h，弃去培养基并保留细胞，4%多聚甲醛固定细胞，免疫组化染色试剂盒进行操作，孵育Bcl-2、Bax、Caspase-3的多克隆抗体过夜后孵育二抗，而后进行二氨基联苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)显色、苏木精复染，显微镜下观察、摄影记录图像并测定A值。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0版软件录入数据并进行统计学处理，3组间计量资料比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1细胞增殖活力 复氧后12，24，48 h，对照组细胞的增殖活力明显高于H/R组、40 μmol·L-1Res组及80 μmol·L-1Res组，80 μmol·L-1Res组高于40 μmol·L-1Res组和H/R组，40 μmol·L-1Res组高于H/R组，均差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2细胞中氧化应激产物含量 复氧后48 h对照组ROS、MDA、AOPP、8-OHdG含量均明显低于H/R组、40 μmol·L-1Res组及80 μmol·L-1Res组，80 μmol·L-1Res组低于40 μmol·L-1Res组和H/R组，40 μmol·L-1Res组低于H/R组，均差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 4组细胞增殖活力比较

组别12 h24 h48 h对照组77.10±1.1085.40±1.2595.11±1.20H/R组55.89±1.11①②③64.50±1.10①②③73.85±1.15①②③Res组 40 μmol·L-167.68±1.12①②77.42±1.18①②82.90±1.10①② 80 μmol·L-172.42±1.08①81.35±1.15①88.88±1.12①

①与对照组比较，P<0.05；②与80 μmol·L-1Res组比较，P<0.05；③与40 μmol·L-1Res组比较，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

表2 4组细胞中氧化应激产物含量比较

组别ROS(MFI平均荧光强度)MDA/(μmol·L-1)对照组0.83±0.113.48±0.52H/R组2.42±0.38①②③10.38±1.65①②③Res组 40 μmol·L-11.79±0.22①②7.65±0.77①② 80 μmol·L-11.20±0.25①5.80±0.85①组别AOPP/(μmol·L-1)8-OHdG/(ng·mL-1)对照组2.29±0.361.95±0.23H/R组6.52±0.94①②③5.51±0.79①②③Res组 40 μmol·L-15.44±0.52①②4.04±0.55①② 80 μmol·L-13.89±0.41①3.00±0.60①

①与对照组比较，P<0.05；②与80 μmol·L-1Res组比较，P<0.05；③与40 μmol·L-1Res组比较，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

2.3细胞中线粒体途径凋亡分子表达量 复氧后48 h对照组Bax、Caspase-3、BaxmRNA表达量、Caspase-3mRNA表达量均明显低于H/R组、40 μmol·L-1Res组及80 μmol·L-1Res组，80 μmol·L-1Res组低于40 μmol·L-1Res组和H/R组，40 μmol·L-1Res组低于H/R组，均差异有统计学意义(P<0.05)；对照组Bcl-2、Bcl-2mRNA表达量均明显高于H/R组、40 μmol·L-1Res组及80 μmol·L-1Res组，80 μmol·L-1Res组高于40 μmol·L-1Res组和H/R组，40 μmol·L-1Res组高于H/R组，均差异有统计学意义(均P<0.05)，见表3，4。

表3 4组细胞中线粒体途径凋亡分子表达量比较

组别Bcl-2BaxCaspase-3对照组1.00±0.161.00±0.191.00±0.14H/R组0.39±0.06①②③2.32±0.37①②③2.55±0.41①②③Res组 40 μmol·L-10.76±0.10①②1.89±0.21①②2.02±0.29①② 80 μmol·L-10.88±0.12①1.44±0.20①1.65±0.30①

①与对照组比较，P<0.05；②与80 μmol·L-1Res组比较，P<0.05；③与40 μmol·L-1Res组比较，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

表4 4组细胞中线粒体途径凋亡分子mRNA表达量比较

组别Bcl-2mRNABaxmRNACaspase-3mRNA对照组0.418±0.0620.215±0.0420.239±0.039H/R组0.252±0.036①②③0.511±0.083①②③0.475±0.062①②③Res组 40 μmol·L-10.303±0.005①②0.342±0.061①②0.351±0.054①② 80 μmol·L-10.338±0.006①0.288±0.059①0.297±0.048①

①与对照组比较，P<0.05；②与80 μmol·L-1Res组比较，P<0.05；③与40 μmol·L-1Res组比较，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

3 讨论

已有研究证实，Res对心脑血管具有保护作用，长期摄入Res能够降低心脑血管疾病发生风险[5-6]。缺血-再灌注损伤可严重影响脑梗死治疗效果，Res对神经元氧化应激损伤具有保护作用[7]。本研究中，笔者将神经元H/R损伤模型作为研究Res抗凋亡和抗氧化作用的工具。为明确H/R过程对神经元的损伤程度，笔者分析了细胞增殖活力，结果显示H/R组细胞复氧后12，24，48 h时增殖活力值均低于对照组，提示H/R模型细胞增殖受到显著抑制。在此基础上进一步分析Res对神经元H/R损伤的影响可知，40 μmol·L-1和80 μmol·L-1Res组细胞复氧后12，24，48 h时增殖活力值均显著高于H/R组，且增殖活力值随着Res浓度升高而提高。这一结果与文献 [4，7]报道一致，说明Res能够减轻H/R所致神经元损伤。

氧化应激反应激活是H/R损伤过程中重要的病理环节，处于缺氧状态的组织和细胞获得血流灌注后会造成ROS大量产生，进而引起细胞中脂质、蛋白质、核酸发生过氧化并生成相应的氧化产物MDA、AOPP、8-OHdG[8-10]。笔者对H/R后细胞中氧化应激产物的分析发现，H/R组细胞ROS、MDA、AOPP、8-OHdG含量显著高于对照组，提示H/R能激活神经元氧化应激反应，导致ROS生成增加并造成细胞脂质、蛋白质、核酸发生过氧化，进而导致神经元结构和功能损伤。Res抗氧化作用和氧自由基清除作用得到一致认可，笔者对Res处理后细胞中氧化应激产物的分析证实，40 μmol·L-1和80 μmol·L-1Res组细胞中ROS、MDA、AOPP、8-OHdG含量显著低于H/R组，且随着Res浓度提高，氧化应激反应减轻，提示Res能够抑制神经元H/R损伤过程中的氧化应激反应，减轻氧化应激反应对神经元的损伤。

Bax和Bcl-2是调节线粒体功能以及线粒体膜对细胞色素C通透性的重要分子，前者能够形成同源二聚体并定位于线粒体膜，增加线粒体膜对细胞色素C的通透性，进入胞质的细胞色素C能够激活Caspase-3并诱导细胞凋亡；后者能够与Bax形成异源二聚体并抑制Bax的促凋亡作用[11-12]。笔者对神经元H/R过程中上述线粒体途径凋亡分子表达量的分析发现，H/R能够显著抑制Bcl-2水平，增加Bax、Caspase-3表达；Res组细胞中Bcl-2的mRNA表达量显著高于H/R组，Bax、Caspase-3的mRNA表达量显著低于H/R组，且该效果与Res浓度间存在密切关联，提示Res能够抑制神经元H/R损伤过程中线粒体途径细胞凋亡。

综上所述，Res能够减轻神经元H/R损伤，抑制H/R过程中的细胞凋亡和氧化应激反应是Res发挥神经元保护作用的分子机制之一。