吕光辉，李星雨，叶方1,，黄良永，卢伟

(1.湖北医药学院附属十堰市太和医院药学部，十堰 442000；2.湖北医药学院药学院药学系，十堰 442000)

毛连菜(PicrisL.)为菊科毛连菜属草本植物，主要活性成分为黄酮类、有机酸类、苷类和萜类物质[1]，笔者拟在前期研究的基础上，进一步改进质量控制方法，建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定毛连菜中绿原酸、木犀草苷和异绿原酸A含量的方法，为深入开发该药材的药用价值提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 戴安UltiMateTM3000型HPLC仪(四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，紫外检测器；Chromeleon软件处理系统)；顶帅FA2004型高速多功能粉碎机(上海市顶帅电器有限公司)；KM-410C型超声清洗机(广东科盟电器有限公司，最大可调功率250 W，40 kHz)；FA-2004电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司，d=0.1 mg)；AUW-120D电子分析天平(日本岛津公司，d=0.01 mg)。

1.2试药 绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-200413，含量：100%)，异绿原酸A(中国食品药品检定研究院，批号：111782-201405，含量：92.0%)，木犀草苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111720-200905，含量：96.5%)；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为自制超纯水。

1.3药材 毛连菜样品采自湖北省十堰市竹山县，药材由湖北医药学院叶方副教授鉴定为单毛毛连菜(P.hieracioidesL.subsp.fuscipilosa Hand.-Mazz)，全草洗净干燥后粉碎，过三号筛[筛孔内径(355±13)μm]备用。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Waters Atlantis T3柱(4.6 mm×150 mm，3 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱：0～10 min，3%→15%A，>10～40 min，15%→30%A。检测波长：348 nm；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。见图1。

2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液的配制 精密称取绿原酸对照品17.88 mg、异绿原酸A对照品12.58 mg，分别置10 mL量瓶，取木犀草苷对照品5.96 mg置25 mL量瓶，用甲醇溶解定容至刻度，即得浓度分别为1.788，1.258，0.238 mg· mL-1绿原酸、异绿原酸A及木犀草苷对照品储备液。分别精密吸取3种对照品储备液各1 mL，置25 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，混匀后以孔径为0.22 μm滤膜过滤，得混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的配制 精密称取药材粉末2 g，置具塞锥形瓶，精密加60%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声(功率：250 W，频率：40 kHz)提取40 min，用60%甲醇补足减失质量，摇匀，用孔径0.22 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项3种混合对照品溶液适量，分别稀释成每毫升含绿原酸596.000，298.000，149.000，74.500，37.250，9.313 μg；异绿原酸A419.333，209.667，104.833，52.417，26.208，6.552 μg；木犀草苷79.467，39.733，19.867，9.333，4.967，1.242 μg的混合对照品溶液，依照“2.1”项色谱条件分别进样，测定绿原酸、异绿原酸A及木犀草苷峰面积，以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得绿原酸的线性回归方程为：Y绿=0.352 6X+1.397 7(R2=0.999 8)，异绿原酸A的线性回归方程为：Y异=0.403X+2.132 8(R2=0.999 1)，木犀草苷的线性回归方程为：Y木=0.552 5X+0.482 8(R2=0.999 6)。说明绿原酸的进样浓度在9.313～596.000 μg· mL-1、异绿原酸A的进样浓度在6.552～419.333 μg·mL-1、木犀草苷的进样浓度在1.242～79.467 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.2精密度实验 将混合对照品溶液按照“2.1”项色谱条件进样10 μL，重复6次，测定绿原酸、异绿原酸A及木犀草苷的峰面积，结果3种对照品峰面积的RSD分别为0.81%，0.93%，0.89%，说明该仪器精密度良好。

1.绿原酸；2.木犀草苷；3.异绿原酸A。

1.chlorsgenic acid；2.glyphosate；3.isochlorogenic acid A.

Fig.1 HPLC chromatogram of Picris L.

2.3.3重复性实验 取毛连菜同一样品(批号：20180805)粉末，按“2.2.2”项制备供试品溶液，共计6份，依据“2.1”项色谱条件进样10 μL，测定样品中绿原酸、异绿原酸A和木犀草苷的峰面积，考察其重复性。结果绿原酸含量为0.186%，RSD=1.47%；异绿原酸A含量为0.142%，RSD=0.89%；木犀草苷含量为0.018%，RSD=0.93%，表明该方法重复性较好。

2.3.4稳定性实验 取同一供试品溶液(批号：20180805)分别在制备后0，4，8，12，24 h按照“2.1”项色谱条件进样10 μL，依次测定绿原酸、异绿原酸A及木犀草苷的峰面积，结果绿原酸、异绿原酸A及木犀草苷的RSD分别为1.35%，1.57%，1.42%，说明该样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5加样回收率实验 精密称取已知含量的样品(批号：20180805)1 g共6份，置具塞锥形瓶，分别精密加入上述对照品储备液各1 mL，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法进行加样回收率实验，测定含量并计算回收率。结果见表1。

表1 绿原酸、木犀草苷及异绿原酸A加样回收率结果

Tab.1 Recovery of chlorogenic acid，luteolin and isochlorogenic acid A

成分样品称重/g样品含量加入量实测总量mg回收率平均回收率RSD%绿原酸1.036 51.9261.7883.70499.441.028 91.9121.7883.704100.231.017 41.8911.7883.710101.76100.281.261.025 91.9061.7883.68599.481.006 51.8701.7883.692101.881.007 51.8721.7883.64198.93木犀草苷1.036 50.1870.2380.432102.551.028 90.1860.2380.41997.791.017 40.1840.2380.42199.5099.951.541.025 90.1850.2380.424100.121.006 50.1820.2380.41999.491.007 50.1820.2380.421100.25异绿原酸A1.036 51.4691.2582.70998.571.028 91.4581.2582.745102.291.017 41.4421.2582.69499.53100.291.441.025 91.4541.2582.70199.131.006 51.4261.2582.703101.481.007 51.4281.2582.695100.73

2.4样品测定 取批号为20180803，20180805，20180806的3批药材，精密称取样品粉末2 g，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下进样，按照外标一点法计算样品中绿原酸、木犀草苷及异绿原酸A的含量。结果见表2。

表2 样品含量

Tab.2 Sample content

%，n=3

3 讨论

3.1样品处理方法的选择 在优化样品制备方法时参考相关文献中方法对50%甲醇[2]、60%甲醇、70%甲醇[3]及50%乙醇、60%乙醇[4]、70%乙醇[3]进行单因素比较，结果60%甲醇对3种成分综合提取率较高。此外还考察了药材提取后挥干溶媒再用甲醇复溶处理样品，结果各色谱峰分离度、灵敏度等色谱属性与超声提取后直接进行含量测定没有明显改善，最终采用60%甲醇超声提取制备供试品。

3.2色谱条件的选择 在优化色谱条件时比较了323,327及348 nm[3]3个检测波长对绿原酸、异绿原酸A和木犀草苷的响应效果，结果发现3种成分在348 nm波长下响应效果、分离度、重复性等均较好，所以确定348 nm作为检测波长。

在选择色谱柱时分别采用了Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱、Waters Atlantis T3(4.6 mm×150 mm，3μm)色谱柱，结果Waters Atlantis T3色谱柱对指标成分的分离度更高，灵敏度、专属性、重复性等均较好，选择作为毛连菜含量测定用色谱柱。

本实验所采用方法操作简单，准确性、重复性、专属性均较好，可作为毛连菜药材质量控制研究方法。