李勇莉，赵秀兰，张宁，董学易，班新超，廖诗晗，刘铁菊

（天津医科大学基础医学院病理学教研室，天津300070）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。在我国，乳腺癌的发病率和死亡率分别高居女性恶性肿瘤的首位和第5 位[1]。雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor-receptor 2，HER-2）均为阴性的三阴性乳腺癌是乳腺癌的一种特殊亚型，约15%～20%乳腺癌患者属于此类型[2]。三阴性乳腺癌较其他类型的乳腺癌发病年龄更早，更易复发和发生远处转移，预后最差[3]。富含精氨酸/丝氨酸卷曲螺旋2（arginine/serine-rich coiledcoil 2，RSRC2），又称为食道癌抑制生长蛋白，是近年来新发现的一种肿瘤抑制基因。它位于12q24，基因表达产物由434 个氨基酸组成[4]。RSRC2 在多种正常器官中广泛表达，而在肺中的表达水平明显高于胃、小肠、肾脏、肝脏等。研究表明，RSRC2 可影响细胞生长和增殖，但是它在肿瘤进展中如何发挥作用鲜有研究[5]。本研究旨在通过调控RSRC2 在三阴性乳腺癌细胞系中的表达，探究RSRC2 对三阴性乳腺癌生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人肾上皮细胞系293T 均购自（美国）ATCC 公司。

1.1.2 实验试剂 DMEM、Opti-MEM 培养基购自（美国）Neuronbe 公司，胎牛血清购自（美国）Gibco公司，质粒和慢病毒包装试剂盒均购自（美国）Genecopoeia 公司：RSRC2 过表达质粒（EX-H8692-Lv201），RSRC2 过表达对照质粒（EX-NEG-Lv201），RSRC2 降表达质粒（HSH017340-31-LvRU6GP）,RSRC2 降表达对照质粒（CSHCTR001-LvRU6GP），慢病毒包装试剂盒（HPK-LvTR-40）。Transwell 小室购自（美国）FALCON 公司，Matrigel 胶购自（美国）Invitrogen 公司。RSRC2 抗体（R36896）购自（美国）NOVUS 公司，GAPDH 抗体（Sc25778）购自（美国）Santa Cruz 公司，二抗购自（北京）中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、293T 细胞培养于添加有10%胎牛血清（FBS）、1%双抗（100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素）的DMEM培养基中，37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 培养293T 细胞，转染前2 d 换成含10%热灭活血清的DMEM 培养基，转染时按照慢病毒包装试剂盒说明书添加相关转染试剂及RSRC2 过表达、降表达和空载体对照质粒，12～14 h后换成含5%热灭活血清和1%双抗的培养基，继续培养48 h 后过滤细胞碎片，收集上清液。在6 孔板中用含56℃热灭活血清的培养基培养MDA-MB-231 细胞24 h，每孔中添加2 mL 病毒液和12 μL Polybrene，12～14 h 后替换成不含Polybrene 的培养基培养，48h 后镜下观察转染效率，嘌呤霉素进行药筛，并建立稳定转染的MDA-MB-231 细胞系。

1.2.3 Western blot 将培养皿中的细胞裂解后提取其蛋白并测其蛋白浓度，将等量的各蛋白上样于10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，于PVDF 膜湿转90 min，pH 值为7.0 的5%脱脂牛奶中封闭1 h，加入适量的一抗，于摇床孵育1 h 后，4℃孵育过夜。次日于摇床1 h 恢复室温，TBST 洗涤缓冲液洗膜3 次，添加对应的二抗，37℃摇床孵育2 h，再次用TBST 洗涤膜3 次，加入发光液后避光显影，拍照保存。采用Image J 进行蛋白条带灰度值分析。

1.2.4 Transwell 迁移侵袭实验 迁移实验不铺Matrigel 胶，侵袭实验需提前在小室上层铺一层Matrigel胶。消化细胞，制备无血清的细胞悬液，调整细胞数至2×105个/mL，取200 μL 无血清细胞悬液添加至上室，500 μL 完全培养基添加至下室，迁移实验培养12 h 后，侵袭实验培养36 h，之后预冷甲醇固定20 min，结晶紫染色1 h，清水冲洗后，用棉签擦拭未穿过的细胞，镜下观察，随机选5 个视野拍照计数并分析。

1.2.5 划痕实验 适量的细胞接种至6 孔板，当细胞融合度达95%，用100 μL 枪头划一直线，PBS 冲洗划掉的细胞，添加含1%FBS 和1%双抗的低浓度血清的培养基，拍照后继续在37℃、5% CO2培养箱中培养。在0、12、24 h 观察愈合情况，并拍照保存。用Image J 软件测各组的划痕面积。

1.2.6 平板克隆形成实验 消化实验所用细胞，制备细胞悬液，调整细胞数至104个/ mL，吸取30 μL细胞悬液和2 mL DMEM 培养基到6 孔板中，培养箱中培养10 d。PBS 冲洗3 遍，冷甲醇固定25 min，结晶紫染色25 min，自来水冲洗后晾干，观察并拍照。

1.3 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用(±s表示，两组间均数比较分析采用t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot 法验证转染效果 Western blot法检测MDA-MB-231 细胞过表达RSRC2 及降表达RSRC2 后，RSRC2 在MDA-MB-231 细胞中的蛋白表达量的变化。结果显示：过表达RSRC2 的MDA-MB-231 细胞中RSRC2 的蛋白表达量明显高于对照组，降表达RSRC2 的MDA-MB-231 细胞中的RSRC2 的蛋白表达量较对照组明显降低（均P＜0.05），见图1。

图1 Western blot 法检测RSRC2 转染后的蛋白表达变化Fig 1 Changes in the expression of RSRC2 protein

2.2 RSRC2 对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响 Transwell 迁移侵袭实验结果显示：迁移实验中，MDA-MB-231 细胞过表达RSRC2 后，与对照组相比，其细胞迁移数目减少，降表达RSRC2 后，与对照组相比，其细胞迁移数目明显增强（均P＜0.05），见图2。侵袭实验中，MDA-MB-231 细胞过表达RSRC2 后，其穿过的细胞数较对照组减少，降表达RSRC2 后，其穿过的细胞数较对照组增加（均P＜0.001），见图3。

图2 RSRC2 对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 迁移能力的影响（100×）Fig 2 Effect of RSRC2 on the migration of MDA-MB-231 cells（100×）

图3 RSRC2 对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 侵袭能力的影响（100×）Fig 3 Effect of RSRC2 on the invasion of MDA-MB-231 cells（100×）

划痕实验中，分别于0、12、24 h 进行观察拍照，结果显示，过表达RSRC2 后的MDA-MB-231 细胞较对照组愈合能力减弱，而降表达RSRC2 后，其结果相反（均P＜0.01），见图4。

图4 RSRC2 对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 愈合能力的影响（40×）Fig 4 Effect of RSRC2 on the healing ability of MDA-MB-231 cells（40×）

2.3 RSRC2 对细胞增殖能力的影响 平板克隆形成实验中，在培养箱培养10 d 后，终止培养，固定、染色、拍照，结果显示RSRC2 过表达、降表达和对照组的细胞都能形成克隆，但是RSRC2 降表达组形成的克隆数目明显多于对照组，而RSRC2 过表达组的结果正好与之相反，差异具有统计学意义（均P＜0.05），见图5。

图5 RSRC2 对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 增殖能力的影响Fig 5 Effect of RSRC2 on the proliferation of MDA-MB-231 cells

3 讨论

乳腺癌具有异质性，其少见亚型三阴性乳腺癌具有独特的病理、遗传和临床特征[6]。由于缺乏内分泌治疗及抗HER2 治疗的有效靶点，至今仍未有针对性的标准的治疗方案，在临床上，化疗仍是治疗三阴性乳腺癌的主要手段[7]。由于三阴性乳腺癌的高度异质性，使癌细胞对紫杉醇等化疗药物易产生耐药，部分三阴性乳腺癌患者预后不良，因此迫切需要寻找新的分子靶点，为三阴性乳腺癌治疗提供可能的新思路[8-9]。

RSRC2 属于富含精氨酸/丝氨酸家族中的成员，在多种肿瘤中呈低表达。研究显示，RSRC2 过表达后可以显著抑制食管癌细胞系TE8 的增殖能力[5]。在结肠癌中的研究发现，细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）降表达细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为增强，同时伴有RSRC2 表达水平的降低[10]。SOCS3 属于细胞因子信号转导家族，它能抑制Janus 激酶（JAK）活性和其下游信号转导及转录激活因子（STAT）蛋白的磷酸化，阻止JAK/STAT 信号通路的激活，进而抑制肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和迁移[11-13]。因此，RSRC2 可能是SOCS3 下游效应因子。本研究通过平板克隆形成实验发现，过表达、降表达及对照组的细胞均能形成克隆，但是形成克隆的数量存在差异：过表达组明显少于对照组，而降表达组多于对照组。因此，本研究结果表明RSRC2在三阴性乳腺癌细胞中发挥了肿瘤抑制基因的作用，其表达能够抑制肿瘤细胞的增殖。

另有研究发现，RSRC2 是调控CD40 的调节蛋白，人类B 细胞系BL2 中RSRC2 降表达后，CD40 的蛋白表达量相应的增加[14]。CD40 是Ⅰ型跨膜糖蛋白，在肿瘤侵袭、转移及血管生成中发挥重要作用[15-17]。此外，文献报道，RSRC2 在胰腺导管癌中的表达水平明显低于正常胰腺组织，且与胰腺导管癌的临床分期呈负相关[18]。RSRC2 表达量与食管癌浸润深度、淋巴结转移、血管浸润呈显著负相关，低表达RSRC2的患者预后差[5]。本课题组的前期研究通过免疫组化检测了RSRC2 在三阴性乳腺癌中的表达情况，发现癌组织中RSRC2 的表达量明显低于癌旁组织。RSRC2 蛋白水平的高低与生存率呈正相关，RSRC2 表达阳性患者生存时间长[19]。本研究通过迁移、侵袭实验及划痕实验发现降表达RSRC2 后，三阴性乳腺癌细胞的侵袭、迁移能力增强，这些体外实验结果说明了RSRC2 能够抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移及侵袭等恶性生物学行为，从而在三阴性乳腺癌的进展中发挥重要作用。

DNA 甲基化是一种重要的表观遗传调控机制。大量研究已经证实，异常的DNA 甲基化通过沉默抑癌基因的表达而增强肿瘤细胞的恶性行为，因此它与肿瘤的发生、发展密切相关[20]。Kurehara 等[5]提出RSRC2 潜在下调机制是RSRC2 的高甲基化。Hernandez-Vargas 等[21]通过KEGG 通路分析发现在乳腺癌细胞中参与JAK/STAT 信号通路的基因表达降低与显著的高甲基化有关。Dong 等[10]研究表明，SOCS3 调节RSRC2 的表达，且两者表达水平呈正相关，而SOCS3 通过抑制JAK/STAT 信号通路而在肿瘤进展中发挥抑制作用。由此，笔者猜测RSRC2的高甲基化引起其表达下调，下调的RSRC2 通过激活JAK/STAT 信号通路，从而在三阴性乳腺癌发生、发展中起作用。

综上所述，RSRC2 在三阴性乳腺癌组织中呈现低表达，降低RSRC2 表达后，三阴性乳腺癌细胞的恶性生物学行为随之增强，表明RSRC2 在三阴性乳腺癌的进展中可能起肿瘤抑制基因的作用，其抑制作用的发挥可能是通过抑制JAK/STAT 信号通路的激活来实现的。接下来，笔者将进行大量的体内外实验验证RSRC2 通过抑制JAK/STAT 信号通路激活而发挥抑制作用这一猜想的正确性，旨在为三阴性乳腺癌治疗提供一些新依据。