董鑫

摘要 选择10株分离自田菁根瘤内的菌株进行结瘤试验，他们分别属于贪铜菌属（Cupriavidus）、拜纳蒙纳斯属（Balneimonas）、克罗诺杆菌属（Cronobacter）、泛菌属（Pantoea）及肠杆菌属（Enterobacter），应用全细胞水溶性蛋白电泳（SDS-PAGE）技术对结瘤后再次分离的菌株进行验证。结瘤试验结果表明，隶属于贪铜菌属（Cupriavidus）和拜纳蒙纳斯（Balneimonas）的7株菌SWF65120、SWF65122、SWF66465、SWF66521、SWF67557、SWF67558、SWF67572都能够与宿主田菁植物结瘤，并应用SDS-PAGE分子标记对结瘤菌株与接种菌株进行了比较，蛋白图谱显示完全一致。

关键词 根瘤菌;内生菌;结瘤;全细胞水溶性蛋白电泳

中图分类号 S182文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）13-0157-02

Abstract 10 strains isolated from the root nodule of Sesbania spp. were selected for reinnoculation nodulation test，these strains belonged to 6 genera，i.e. Cupriavidus， Balneimonas ，Cronobacter， Pantoea and Enterobacter. The whole cell protein SDSPAGE method analysis demonstrated that 7 original strains （SWF65120，SWF65122，SWF66465，SWF66521，SWF67557，SWF67558，SWF67572）had an identical protein pattern with their reisolated strains at higher similarity， it indicated that these strains could establish symbiotic nodulation connection with their original Sesbania spp. hosts.

Key words Rhizobia;Endophyte;Nodulation;SDSPAGE

根瘤菌（rhizobia）是一類广泛遍布于土壤中的革兰氏阴性细菌。它能够侵染豆科植物根部与之共生，并帮助豆科植物吸收空气中的氮，转化为植物能够利用的氮素营养。然而，在研究根瘤菌的同时，还在根瘤内分离出除根瘤菌外的其他非共生细菌，如Agrobacterium tumefaciens，Pantoea agglomerans等[1]，这类细菌不是污染所致，他们的特点是不具有共生基因和结瘤基因，不能够使豆科植物根部结瘤，属于根瘤内生菌。内生菌是指长期生活在植物体内，对植物本身不引起侵害或产生积极作用的一类细菌或真菌的总称。内生菌具有广阔的研究开发前景，在研制植物菌剂、生物医药及生物农药等领域得到应用[2]。但目前国内对内生菌研究成果较少。

SDS-PAGE是最常用的蛋白表达分析技术。其原理是基于蛋白质分子量的大小，将不同大小的蛋白质分离，该技术常用于检测蛋白质亚基的分子量、鉴定纯度及鉴定菌株，其特点是操作简单，重复性好，分辨率高[3]。笔者采用全细胞蛋白电泳技术SDS-PAGE对10株来自田菁根瘤内的菌株和回接后重新分离得到的结瘤菌株进行比对，以验证分离自田菁的根瘤菌与田菁的共生结瘤关系。

1 材料与方法

1.1 种子处理方法

结瘤试验所用的种子为田菁属植物的种子。用98% 浓硫酸[4]浸泡1 h，无菌水漂洗5～10次，置于湿润的装有无菌滤纸的培养皿中28 ℃萌发，待幼芽萌发至0.5 mm后，转入4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2 结瘤试验

将玻璃试管（规格为300 mm×350 mm）中放置滤纸折叠成能够支撑幼苗的斜面，并于试管内装入120 mL无氮培养液，封口后121 ℃灭菌30 min，冷却后室温放置。将萌发好的种苗在菌液中浸泡1 h以上，将其放置于滤纸斜面上，每株接种菌株设3个重复，同时设5个不接种菌液的试管作为对照[5]。置于恒温箱中，28 ℃培养，其间观察结瘤情况，培养45 d后停止培养并收集根瘤。

1.3 分离和纯化

选取饱满健壮的根瘤进行分离，将根瘤置于0.2%汞中表面消毒3 min，无菌水冲洗3～5次。用无菌竹签将根瘤压破使根瘤内菌液流出，挑取一环菌液于YMA培养基上划线[6]，并用封口膜将培养皿口封住，28 ℃倒置培养至长出菌落。待培养基上长出菌落后标记，并分别挑取少许菌体进行革兰氏染色、镜检。蘸取一环菌落放入经灭菌处理的装有小玻璃珠和无菌水试管中，振荡3 s后，蘸取菌液于 YMA平板上划线，28 ℃倒置培养，重复上述纯化操作1～2次。

1.4 菌体的培养和收集

将纯化后的供试菌接入TY斜面试管中28 ℃培养。用 pH 7.0的 TrisHCl缓冲液离心洗涤菌体3～4次，-20 ℃保存备用。

1.5 样品的制备

样品制备采用煮沸法，将制备的样品等比例与2×样品缓冲液混合，沸水浴变性10 min，然后置于-20 ℃保存备用。

1.6 制胶SDS-聚丙烯酰胺凝胶配比见表1。

1.7 注胶与上样

注胶前，用洗洁精仔细清洗玻璃板，蒸馏水反复冲洗干净，然后竖立晾干。将清洗干净的玻璃板两端对齐后，用夹子加紧，避免漏胶，然后垂直放置。注胶时，用吸管或枪头将胶液沿玻璃板缓缓注入，避免产生气泡。注胶完成后，将梳子水平插入胶中，凝结后，两端竖直将梳子拔起。然后将玻璃板垂直放入电泳中，加入电泳液后，使用微量进样器将样品注入齿隙中。

1.8 染色

采用灵敏度高的银染色法。电泳结束后，将分离胶浸泡于固定液中6 h，使蛋白质沉淀。取出凝胶放入浸泡液中，摇床上平缓摇动，然后凝胶多次反复水洗，以去除SDS。再将凝胶放入硝酸银染色溶液中，摇床上平缓摇动染色。然后用去离子水冲洗凝胶。将凝胶放入显色液中平缓摇动，显色后，立即放入终止液中[7]。

1.9 结果处理 所有电泳图谱在扫描仪上扫描后以图片保存，用Quantity One软件对电泳条带进行判读。

2 结果与分析

2.1 结瘤试验结果

各菌株的结瘤情况见表2。接种18 d后，部分田菁根部已经形成根瘤，至接种30 d后，除 SWF66517、 SWF67634和 SWF67639未结瘤外，其余7株接种菌株均与田菁植物结瘤，结瘤数量为3～8个/株，对照组全部没有结瘤。部分根瘤情况见图1。

2.2 结瘤菌株的SDS-PAGE验证

从结瘤试验所结根瘤中分离获得7株菌株，与各自的接种菌株一起进行 SDS-PAGE全细胞蛋白电泳分析，发现 SWF65120、 SWF65122、 SWF66465、 SWF66521、 SWF67557、 SWF67558及 SWF67572接种菌株的蛋白图谱与其对应的结瘤菌株图谱相同（图2）。

3 结论与讨论

结瘤试验结果表明，SWF66517、SWF67634和SWF67639这3株分别为肠杆菌属（Enterobacter）、泛菌属（Pantoea）和克罗诺杆菌属（Cronobacter）没有结瘤，这并非操作过程中菌株染污所致，而是因为他们是根瘤内的内生细菌。因此，应进一步将这些分离自根瘤内但单独不能侵染根瘤的内生菌与根瘤菌混合回接，以研究他们进入根瘤内的途径和在根瘤内与根瘤菌的共处模式，对根瘤内微生态的研究具有重要意义。

从结瘤试验所结根瘤中重新分离获得7株结瘤菌株，应用全细胞水溶性蛋白电泳技术（SDS-PAGE）将回接菌株和结瘤菌株进行对比分析，结果表明，SWF65120、SWF65122、SWF66465、SWF66521、SWF67557、SWF67558、SWF67572这7株接种菌株的图谱与结瘤菌株相同，表明此7株菌株确系与植物田菁存在共生关系。而他们分别为贪铜菌属（Cupriavidus）和拜纳蒙纳斯属（Balneimonas）。在以往的报道中，Chen等[8-9]研究证实了贪铜菌属（Cupriavidus）能够与含羞草有效结瘤，但拜纳蒙纳斯属（Balneimonas）具有结瘤能力尚未见报道。因此，需要对其做平均核苷酸一致性[10]（average nucleotide identity）比较分析，以进一步确认其系统发育地位。

参考文献

[1] 刘杰，汪恩涛，陈文新.豆科植物根瘤内生细菌的发现及其研究进展[J].微生物学报，2011，51（8）：1001-1006.

[2] 韩继刚，宋未.植物内生细菌研究进展及其应用潜力[J].自然科学进展，2004，14（4）：374-379.

[3] CHEN W M，JAMES E K，COENYE T，et al.Burkholderia mimosarum sp.nov.，isolated from root nodules of Mimosa spp.from Taiwan and South America [J].International journal of systematic and evolutionary microbiology，2006，58：1847-1851.

[4] 吕玉兰，黄家雄，刘倩.热水和浓硫酸处理对12个野生豆科草种种子萌发的影响[J].西南农业学报，2010，23（5）：1669-1672.

[5] 郭振国.海南省含羞草根瘤菌的多相分类研究[D].保定：河北大学，2011.

[6] 肖猛.干旱草原豆科植物根瘤菌物种多样性研究及应用试验[D].保定：河北大学，2011.

[7] 王风芹.合欢、金合欢和银合欢根瘤菌多相分类与系统发育研究[D].北京：中国农业大学，2005.

[8] CHEN W M，LAEVENS S，LEE T M，et al.Ralstonia taiwanensis sp.nov.，isolated from root nodules of Mimosa species and sputum of a cystic fibrosis patient [J].International journal of systematic and evolutionary microbiology，2001，51（5）：1729-1735.

[9] CHEN W M，JAMES E K，PRESCOTT A R，et al.Nodulation of Mimosa spp.by the βproteobacterium Ralstonia taiwanensis[J].Molecular plantmicrobe interactions，2003，16：1051-1061.

[10] 陳文峰.根瘤菌系统学研究进展与展望[J].微生物学通报，2016，43（5）：1095-1100.