蒲佳洪 罗学刚 王经明 梁朱明

摘要：通过选择培养基筛选出混合硫酸盐还原菌，并研究其最适的生长条件，考察了接种量、温度、最初pH、Fe2+对其生长的影响。结果表明，在接种量为10%，温度为35 0C，初始pH为6.5，培养基内Fe2+为200 mg/L时，混合硫酸盐还原茵生长最好。

关键词：混合硫酸盐还原菌;接种量;温度;初始Fe2+

中图分类号：X703

文献标识码：A

文章编号：0439-8114（ 2020） 08-0054-04

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439- 8114.2020.08.011

随着中国核军工和核电的快速发展，对铀资源的需求及对铀矿的开发也在不断增加。在铀矿开采、核电站设施运行过程中产生的含铀废水和工艺废水也随之增多[1]。这些铀污染水体具有产量大、放射性活度低、半衰期长等特点，会对周围生态环境造成潜在的危害[2，3]。进而这些铀污染水体通过各种环境因素进入人体，影响人们的身体健康，因此关于铀矿等产生的铀污染水体受到了越来越多的关注，有效处理铀污染水体已成为了一个亟待解决的环境问题。

处理铀污染水体的方法主要有化学沉淀、蒸发浓缩、吸附、膜分离、氧化还原等[4-6]。传统的物理化学方法处理铀污染水体存在操作复杂、成本高、容易造成二次污染等缺点[7]。而利用微生物来处理铀污染水体已经被证明是一种可行的方法，尤其是在处理污染面积大、铀污染水体中铀浓度较低时能够显著地降低处理成本[8，9]。

迄今为止，对铀污染水体的处理一般都是对污染水体中的铀进行吸附或者还原。Barlett等[10]研究发现添加Fe3+会促进硫酸盐还原菌（ Sulfate-reduc-ing bacteria，SRB）对U（VI）的还原能力;汪爱河等[11]在缺氧的环境下，利用零价铁和SRB混合来处理铀污染水体，在最佳还原条件下，铀的去除率高达93.49%;谢水波等[12]探讨了S042-、Fe0对硫酸盐还原菌颗粒吸附U（VI）的影响，表明在S042-浓度低于1 500mg/L时，能促进硫酸盐还原菌颗粒去除U（VI），并且投加铁粉会提高去除速率，在20 h内，U（VI）的去除率达到100%。以上研究都是对铀进行还原或吸附来处理铀污染水体，但吸附还原处理后又产生了其他的污染。

采用微生物硫酸盐还原菌来去除污染水体中的铀，但单一的SRB处理方法受环境条件的影响明显，如pH要求在5-8、温度在30-35℃，所以单一的菌种不能处理超出菌种生长条件的铀污染水体，其应用受到限制[13，14]。而混合的SRB能增加其对环境的耐受性，可以提高微生物的处理效果。而放射性重金属一般对微生物有一定的抑制作用，因此，本试验将从某尾矿区各处污染水体中取样，筛选出耐铀的混合硫酸盐还原菌，并研究该混合菌的最适生长条件，旨在为后续的处理铀污染水体提供有效的微生物原材料，研究该混合菌的最适生长条件，为后续处理铀污染水体提供便利。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 水样高浓度的重金属可以抑制微生物的生长和繁殖，阻碍呼吸作用，使细胞形态异常，使细胞裂解甚至改变核酸和蛋白质的结构，干扰氧化磷酸化，影响细胞渗透压平衡。所以直接在某尾矿区水源中取样，在尾矿区生长的微生物有一定的耐受能力。分别在尾矿坝的上游水边、尾矿坝中心水边和尾矿坝下游水边设置3个取样点，而土壤中含有的微生物比水中多，故在每个取样点水下5-10 cm处用铲子取淤泥1 000 g，装入样品袋密封，室温保存。

1.1.2 培养基因为硫酸盐还原菌属于厌氧菌，需要用特殊的选择培养基筛选。本试验采用以乳酸钠为碳源改良的Starkey培养基，各成分（g/L）如下：K2HP04 0.5，NH4CI l.0，Na2S04 0.5，65%乳酸鈉5.0，CaCl2 0.076， MgS04. 7H20 2.0，（ NH4） 2Fe（ S04）2. 7H2O0.5，抗败血酸0.1，酵母浸膏1.0。

1.1.3 仪器 台式数显pH计，常州三丰仪器科技有限公司;生化培养箱，北京市永光明医疗仪器有限公司;电子天平，奥豪斯仪器有限公司;可见光分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 筛选混合的硫酸盐还原菌将取回的淤泥与改良的Starkey培养基按1：1的体积比放人100 mL医用厌氧瓶中，再向瓶内通入氮气5 min，保证瓶内无氧气，盖上瓶盖，再用橡皮塞封口，把医用厌氧瓶放于35℃恒温生化培养箱培养。培养一段时间观察其颜色、气味等，筛选出混合的硫酸盐还原菌，单一的菌种限制因素多，有的菌种要特定的pH、温度等。采用混合的硫酸盐还原菌提高其适应范围，且单一的菌种对还原矿化效果没有混合菌好。

1.2.2 混合SRB最适生长条件 分别研究4个因素对混合SRB生长的影响。

1）接种量。接种量是指向培养基中加入混合菌的体积和培养基体积的比例。接种量的多少会影响混合菌的新陈代谢和生长繁殖，采用较大的接种量可以缩短混合菌生长达到最高峰的时间;接种量过少延滞生长的时间变长。所以接种量的多少能影响混合菌的生长[15]。分别以5%、10%、15%的接种量将筛选出来的混合菌接种到已配好的培养基中，置于35℃恒温培养箱中培养，每隔8h利用可见光分光光度计测定该混合菌OD。

2）初始pH。pH影响膜的通透性及膜表面电荷的性质，从而对物质的吸收产生影响。微生物生长需要合适的pH，且H+离子浓度会影响硫酸盐还原酶系的构象和生物学活性。有研究显示，硫酸盐还原菌的活性最高一般处于6.0-7.5，处理硫酸盐的效果最好[16]。一般来说，铀尾矿坝浸出的铀污染水体均呈酸性，需要通过驯化来提高该混合菌对酸的耐受性。本试验将混合菌接种于培养基中培养，调节培养基初始pH为3.0-7.5，每0.5 一个梯度，每隔8h利用可见光分光光度计测定该混合菌OD，重复5次，取平均值，得出每个pH条件下的最大OD。

3）温度。温度会影响混合菌内酶的活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响混合菌的生长代谢。有研究表明SRB最佳生长温度约为30℃[17]。但硫酸盐还原的速率一般在温度为35℃时达到最大，但反应过程不仅受温度影响，还受其他因素影响，所以本试验设置温度梯度为10、20、25、35℃，将培养基放在4个不同温度的恒温培养箱内培养，每隔8h用可见光分光光度计测定其OD。

4） Fe2+质量浓度。二价铁离子是细胞色素C3的重要组成部分，细胞色素C3能作为电子载体参与低电位的氧化还原反应，不同硫酸盐还原菌的纯化氢酶所催化的放氢反应仅在有细胞色素C3存在时才能以较高的速率进行。二价铁离子的存在会影响细胞产生细胞色素C3的数量，而细胞色素C3在整个电子传递过程中参与转移蛋白，所以二价铁离子对整个电子传递链有间接的促进作用。考察培养基内含有不同Fe2+质量浓度对混合菌生长过程的影响，分别调节培养基中Fe2+的初始质量浓度为0、50、100、200、400mg/L，培养温度为35℃，每隔8h用可见光分光光度计测定其OD，重复5次，取平均值，得到每个Fe2+质量浓度下最大的OD。

2 结果与分析

2.1 筛选混合硫酸盐还原菌（SRB）

从图1可以看出，经过7d的培养，接种尾矿坝中心水源边上的淤泥和尾矿下游的厌氧瓶内全部呈现黑色，上游颜色未变。尾矿坝中心水源边上的厌氧瓶内黑色更深，还有浓烈的臭鸡蛋气味产生，得到的硫酸盐还原菌更多。这是因为在无氧条件下，硫酸盐还原菌还原培养基内的硫酸根离子产生H2S，初步断定尾矿坝中心水源边上的淤泥中含有大量的硫酸盐还原菌。本试验并没有对得到的混合硫酸盐还原菌进一步分离纯化，是因为有的菌种要特定的pH、温度等。采用混合的硫酸盐还原菌提高其适应范围，且单一的菌种对还原矿化效果没有混合菌好。从厌氧瓶中取25mL菌液置于250mL厌氧瓶中进行扩大培养，7d后得到扩大培养的混合硫酸盐还原菌。

2.2 混合SRB的最适生长条件研究

2.2.1 接种量对混合SRB生长的影响 从图2可以看出，5%的接种量会使混合SRB延滞生长36 h，在36-72 h，每隔8 h OD625nm增加0.01-0.02，至72h细菌数量OD625 nm达最大，为0.22;而10%和15%的接种量都使混合菌的数量在48h达到最大值，OD625nm分别为0.40和0.42，0-48 h代表细菌数量的OD625nm增加都在0.04-0.10，增幅在20%-30%，比较明显。因此，后续试验采用接种量为10%进行。2.2.2初始pH对混合SRB生长的影响从图3可以看出，pH在3.0-4.0时，混合菌生长受到抑制，OD625nm都在0.03左右，基本没有生长，强酸性环境下氢離子与细胞膜上酶的相互作用受到影响，从而抑制了混合菌的生长;在pH为4.5时，开始有一定的生长，OD625nm达到0.13;pH为4.5-6.5时，混合菌的数量呈上升趋势，至pH为6.5时，OD625—从0.13上升到0.36，达到最大，pH每上升0.5，OD625nm增加35%-50%;pH在6.5-7.5，混合菌的数量有一定的减少。因此，pH为6.5是该混合硫酸盐还原菌的最适pH。

2.2.3 温度对混合SRB生长的影响 由图4可以看出，在温度为10、20℃时，OD625nm在0.05左右，混合SRB几乎没有生长，温度太低，生长代谢几乎停止，活性受到很大的抑制;温度在25℃时，混合菌在0-40 h基本没有生长，OD625nm保持在0.05，之后缓慢生长，在80 h时，OD625nm。达到0.18左右;在温度为35℃时，生长48 h细菌OD625nm达到最高峰，为0.36，之后由于竞争关系，混合菌的数量减少，在80 h时OD625nm减少至0.24。在温度为35℃时，混合菌48 h就达到了生长的最高峰，而在温度为25℃时要到80 h时才具有一定的生长，且混合菌数量均比25℃时多。因此，温度在35℃时为该混合SRB的最适生长温度。

2.2.4初始Fe2+质量浓度对混合SRB生长的影响 由图5可以看出，初始Fe“质量浓度为0-200mg/L，随着浓度的增加，混合SRB数量增加，Fe2+质量浓度为0时，OD625nm为0.24，Fe2+质量浓度为50 mg/L时，OD625nm为0.40，Fe2+质量浓度为100 mg/L时，OD625nm为0.42，Fe2质量浓度为200 mg/L时，OD625nm为0.44，说明在0-200 mg/L质量浓度范围内，Fe2+促进混合菌的生长;在质量浓度为400mg/L时，混合菌的数量明显减少，OD625nm下降到0.28，说明在初始Fe“质量浓度大于200mg/L后，Fe2+对混合菌生长的促进效果不明显。因此，在配制培养基时，Fe2+质量浓度应控制在200mg/L。

3 讨论

3.1 接种量

当接种量过低时，生长物质弥散到细胞外，致使细胞内的生长物质浓度过低，此时细胞不能增殖，抑制细胞生长，细胞变圆不能贴壁，甚至引起细胞死亡[18]副。这是在接种量为5%时，混合SRB生长受到延滞的原因;当接种量过高时，每个细胞周围培养液的容积降低，由于弥散率的降低，细胞内生物质的浓度增加，容易使排除物或代谢产物达到饱和，能量也很快耗尽，因此也会阻碍细胞的生长繁殖[18]。而在接种量为10%和15%时，混合SRB的生长曲线基本相同，初步判定这是该混合硫酸盐还原菌的适宜接种量。

3.2 初始pH

pH在3.0-4.5时，属于强酸性环境，大量的H+离子会影响细胞膜的通透性和膜上电荷的变化，抑制了混合SRB的生长。pH在4.5-6.5时，混合SRB有一定的适宜条件，开始呈对数生长，在pH为6.5时混合SRB的数量达到最大值。而在pH大于6.5时，由于细胞竞争，培养基内生长物质减少、代谢产物的积累等原因，使细胞数量有一定的减少。所以选取pH 6.5为}昆合硫酸盐还原菌的最适pH。

3.3 溫度

当外界温度分别为10和20℃时，由于温度过低，减少了混合菌的代谢作用[19]。在56 h时开始缓慢生长。温度在25℃时，混合菌前40 h基本没有生长，OD625nm保持在0.05，之后缓慢生长，在80 h时OD625nm达到0.18左右。微生物生长的最适温度由温度对细胞内无数个酶反应的影响综合决定[20]，在0-40 h有部分的酶反应在进行，但混合SRB数量并没有增加。40-80 h代谢产物的积累可能使其他酶反应也开始进行，所以该混合菌有一定的生长。当温度在35℃时，该混合菌的生长曲线符合微生物的一般生长曲线，在48 h时达到了最高点，而后有一些减少。因此，选取35℃为混合硫酸盐还原菌的最适温度。

3.4 初始Fe2+质量浓度

二价铁离子主要通过影响细胞呼吸传递链的电位变化来影响微生物的生长[21]。初始Fe2+质量浓度在0、50、100 mg/L时，OD625nm都没有达到最高，说明初始Fe2+质量浓度不够，细胞色素C3的数量过少，影响了硫酸盐还原菌氢化酶催化的放氢反应，该混合菌的生长并没有达到最佳的条件。当初始Fe2+质量浓度在200mg/L时，OD625nm达到最大，为0.44，最适合该硫酸盐还原菌的生长。当初始Fe2+质量浓度在400mg/L时，OD625nm降到0.28，是因为过量的金属离子会抑制混合菌的生长[22]。

4 小结

1）试验结果显示，只有接种尾矿坝中心水源边上的淤泥里含有大量的硫酸盐还原菌。

2）通过试验得出该混合硫酸盐还原菌的最适生长条件为接种量10%，pH为6.5，温度为35℃，初始Fe2+质量浓度为200mg/L。

3）后续研究利用混合硫酸盐还原菌氧化还原去除铀污染水体中的铀，需对筛选得到的混合菌进行驯化，以提高混合菌对环境的耐受性和对铀的去除效果。

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基金項目：国家国防基础科研计划项目（ JCKY2016404C002）

作者简介：蒲佳洪（1993-），男，四川巴中人，在读硕士研究生，研究方向为污染环境生物效应与生态修复，（电话）13320908460（电子信箱）327452675@qq.com;通信作者，罗学刚（1957-），男，教授，博士，主要从事生物质资源利用和污染环境控制与生物修复的教学和科研工作，（电子信箱）lxg@swust.edu.cn。