吕翠，张亮，黄军，刘清术，郑井元，王运生，戴良英，陈武*

(1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128；3.湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009；4.湖南省蔬菜研究所，湖南 长沙 410125)

内生菌作为植物微生态系统的重要组成部分，几乎可定殖于植物的各个组织，它们之间存在共生、竞争和对抗等各种关系[1]。辣椒组织中存在大量内生菌。LEE 等[2]从辣椒果实中筛选到能拮抗辣椒炭疽病的内生菌，对辣椒炭疽病的盆栽防效可达79%；YANG等[3]从辣椒植株根际和叶片中分离到17 株生防菌，其中对疫病的防效最高达92.3%；李娟等[4]从辣椒植株的茎、叶和果肉中分离到能拮抗辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、辣椒黑霉病菌(Stemphylium botryosum) 和辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，对辣椒疫病的生防效果达到74%。

将分离自不同生态位，或者具有不同抑菌活性的生防菌株进行复配，可以实现多菌株之间的优势互补，增加自然竞争力和存活力，提高防病效果[5]。李凤等[6]将生防菌株B01-2 和B23-1 复配，对撑绿杂交竹枯萎病的防效达81.5%，高于单一菌株B01-2(70.4%) 与B23-1(63.0%) 的防效；张维等[7]发现复配拮抗菌群FP246(沙福芽孢杆菌YJC-4、枯草芽孢杆菌CY106/CY111)对烟草黑胫病的温室盆栽平均防效为85.40%，优于单一菌株的防效。

辣椒果实胎座是着生种子的组织，也是合成和贮存辣椒素的主要部位。笔者以辣椒白绢病菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)为靶标菌，尝试分离和鉴定辣椒果实胎座中的拮抗细菌，并通过盆栽试验对部分拮抗菌株的生防效果进行观察测试，以期为防治辣椒白绢病提供生防菌资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试辣椒品种博辣天星、辣椒白绢病菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)LJB-2、辣椒疫病病原菌(Phytophthora capsici)LYB-1 和辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)LCB-3，均由湖南省农业科学院蔬菜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 辣椒果实胎座内生细菌的分离纯化与鉴定

辣椒果实用75%乙醇表面消毒[8]后，在超净台内将其撕开，取果实胎座0.5 g，研磨成匀浆后加入1 mL 无菌水，2 000 r/min 离心2 min，取上清液100 μL，分别在PDA 培养基[9]、辣椒根际土壤培养基、辣椒叶培养基和辣椒根系培养基[10]的固体平板上涂布均匀，30 ℃恒温培养2 d，分别统计菌落数量，按照文献[11]的方法，对菌落类型进行分类。

将分离得到的辣椒胎座内生细菌进行单菌落划线纯化。以辣椒白绢病菌LJB-2 作为靶标菌，将白绢病菌菌块接种于NB 平板中央，挑取纯化的单菌落接种于距平板中央2.5 cm 处的3 个角点处，以仅接白绢病菌LJB-2 的平板作对照，每处理3 次重复。30 ℃恒温培养7 d，观察菌株的拮抗作用，测定病原菌菌落扩展半径，并计算各个菌株的菌落生长抑制率[12]。另分别以辣椒疫病LYB-1 和辣椒炭疽病LCB-3 为靶标菌，测试内生菌株的广谱抑菌活性。

参考试剂盒说明书提取各个细菌菌株的基因组DNA，PCR 扩增16S rRNA 的通用引物序列为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R (5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR 反应体系(50 μL)：2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL、引物27F 1.5 μL、引物1 492R 1.5 μL，用ddH2O 补 足 至 50 μL。PCR 反应程序：98 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s；退火30 s，延伸90 s(30 个循环)； 72 ℃延伸10 min。将所得PCR 扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司测序。将测序结果进行BLAST 比对，运用MEGA7.0 软件构建菌株的系统发育树。

1.2.2 生防菌株防控白绢病的盆栽试验

将辣椒种子播于育苗盆中，待辣椒苗长至6 叶期时，移栽至25 cm×20 cm×16 cm 的花盆中，每盆1 株，每盆1 500 g 土壤。设2 个单菌菌悬液、菌悬液等比例混合、空白对照(ddH2O)4 个处理。每株辣椒苗根部浇施100 mL 菌悬液，3 d 后接种辣椒白绢病菌，每处理15 株辣椒苗，重复3 次，接种后30 d观察辣椒白绢病的发病情况，记录发病率并计算防效。菌种活化及接种方法如下。

分别在LB 固体培养基上划线活化生防菌株，挑单菌落接种于LB 液体培养基过夜培养, 按5%比例将新鲜种子液接种到LB 发酵培养基中，30 ℃、220 r/min 发酵培养15 h，离心，收集菌体，再用ddH2O 重悬至菌体密度为1×108cfu/mL，备用。

在PDA 平板上活化培养辣椒白绢病菌，取直径5 mm 菌饼接种麦粒培养基[13]，每瓶培养基接种5～6 个菌饼，28 ℃培养，待菌丝长满麦粒的表面，取一颗麦粒贴于长至6 叶期的辣椒苗茎基部。

2 结果与分析

2.1 辣椒果实胎座生防细菌的鉴定结果

对PDA 培养基、辣椒根际土壤培养基、辣椒叶培养基和辣椒根系培养基上的菌落分别计数，并根据菌落外观形态特征对菌株进行粗略分类。从分离的菌落数量来看，PDA 培养基分离的菌落数量最多，达到(11.73±4.96)×103cfu/mL，其后依次是辣椒根际土壤培养基(9.73±0.23)×103cfu/mL、辣椒根系培养基(8.20±0.92)×103cfu/mL 和辣椒叶培养基(7.47±1.70)×103cfu/mL；从分离的菌落种类来看，辣椒根际土壤培养基分离得到的菌落种类最多，有6 类，PDA 培养基和辣椒叶培养基的各有5 类，辣椒根系培养基的有4 类。

从20 个种类细菌中每类随机挑选3 个菌株，共60 个菌株，分别与白绢病菌LJB-2 对峙培养，计算菌落生长抑制率，抑制率超过30%，判定有良好的抑制作用。初筛结果表明，共有13 株细菌对辣椒白绢病菌LJB-1有抑制作用，其中G242、T443、T151、G241、YZ12、T442 等6 株细菌对白绢病菌的抑制率高于50%(表1)。

表1 辣椒果实胎座生防菌对辣椒白绢病菌的拮抗能力 Table 1 Antagonistic ability of isolates against Sclerotium rolfsii

将这6株菌株分别与辣椒疫霉病菌LYB-1和辣椒炭疽病菌LCB-3 对峙培养, 结果这6 株拮抗菌对辣椒炭疽病菌和疫霉病菌有良好的抑制作用(图1)，对辣椒炭疽病菌LCB-3的抑制率为(61.71±11.33)%～(76.58±1.55)%，对辣椒疫霉病菌的抑制率为(48.65±2.70)%～(56.76±9.74)%。

图1 菌株T443 与辣椒病原菌的平皿对峙培养结果 Fig.1 The antifungal activities against 3 pepper pathogen by biocontrol bacteria strain T443

将菌株YZ12、G241、T151、T442、G242 和T443 的16S rRNA 序列在GenBank 中进行同源性比较，结果YZ12、G241、T151 和T442 与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性分别达到99.59%、99.49%、100%和97.73%，G242 和T443与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的同源性分别达到98.66% 和99.18% 。构建系统发育树，YZ12、G241、T151 和T442 与解淀粉芽孢杆菌(登录号为EF423607)聚在同一个分支，据此将这4 个菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌；菌株G242 和T443与贝莱斯芽孢杆菌(登录号为KY694464)聚在同一个分支，将这2 个菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(图2)。

图2 6 株拮抗细菌的16S rRNA 区域的进化树 Fig.2 Phylogenetic tree of the 16S rRNA region of 6 antagonistic bacteria

2.2 生防菌株对辣椒白绢病的盆栽防效

接种辣椒白绢病菌后，各个处理均不同程度发病，其中对照组的发病率为85.27%，G241 和T443菌悬液处理后的辣椒白绢病发病率分别为60.42%和52.73%，防效分别为29.14%和38.16%；复配处理的发病率为9.88%，防效为88.41%，菌株复配大幅提高了对白绢病的防治效果。

3 讨论

辣椒白绢病、疫病和炭疽病都是辣椒真菌性病害，从辣椒种子、根、茎和叶中挖掘生防资源的研究报道较多。本研究基于4 种培养基，从辣椒果实胎座中分离得到20 个菌落种类，从每个菌落种类中随机挑选3 个菌株(合计60 个菌株)，分别与辣椒白绢病菌、辣椒疫霉菌和辣椒炭疽病菌进行平皿对峙培养，筛选得到YZ12、G241、T151、T442、G242和T443 等6 株具有抑菌活性的菌株。鉴定结果表明，它们分属解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌。这2 种芽孢杆菌被公认为植物促生微生物[14]，因而在后续应用上符合对环境和生态安全的要求。

考虑到影响生防菌定殖的环境因素多，田间防效不稳定等突出问题，目前探讨生防菌株复配后的协同增效现象的研究[15]较多。本研究发现菌株G241 与T443 复配相对于单个菌株对辣椒白绢病的防治效果大幅提高，后续将从生防菌株的定殖、对辣椒根际微生物的影响、以及抑菌活性物质鉴定等方面探究菌株复配后协同增效的机制。