马艳华，黄 芬，王文尖

紫草素作为我国传统中药紫草科植物硬紫草根中的主要活性成分，具有很好的抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫功能的功效，尤其是其抗肿瘤作用引起了广大科研人员的关注[1，2]。研究证实，紫草素主要是通过诱导细胞凋亡、抑制拓扑异构酶和蛋白酪氨酸激酶、抗血管生成和影响肿瘤信号传递途径等而发挥抗肿瘤作用[3]，并且对乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和宫颈癌等[4-7]癌细胞都有很好的抑制生长作用。本实验采用不同浓度的紫草素处理人肝癌HepG2细胞，分析了紫草素对肝癌细胞增殖、凋亡、自噬等进程的影响，并对其可能的调控机制进行了探讨，以期为紫草素用于肝癌的临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂与仪器 人肝癌HepG2细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，本实验室自行保存、传代备用。紫草素(中国药品生物制品鉴定所，纯度≥98%)；胎牛血清(FBS)和RPMI培养基(Gibco公司)；兔抗人Bax、抗Bcl-2、抗Caspase-3、抗LC3-I/II、抗p62、抗p-P13K-p85、抗P13K-p85、抗Akt、抗p-Akt、抗p65、抗p-p65和抗β-actin抗体(美国Abcam公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；酶标仪(美国Bio-Tek公司)。

1.2 细胞培养与处理 取HepG2细胞，培养于含10% FBS、100 U/mL青霉素的完全RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO2加湿培养箱中培养，每2～3 d换液、传代，待细胞进入对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞数为5×104个/mL细胞悬液，分为4组，用事先配置好的1.2 mmol/L的紫草素母液进行稀释，使每组培养细胞的药物浓度分别为0(对照)、1、2.5和5 μmol/L，处理48 h，进行后续相关检测。

1.3 各组HepG2细胞增殖检测 采用MTT法，取上述处理过的细胞悬液，接种于96孔板，在每孔中滴加浓度为5 mg/mL的MTT溶液20 μL，避光继续培养4 h，加入二甲亚砜200 μL，振荡混匀10 min，使用酶标仪检测各组细胞在波长570 nm下的吸光度(OD)值，并根据公式计算细胞增殖抑制率=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.4 各组HepG2细胞凋亡检测 使用流式细胞仪检测，取处理细胞悬液，接种于6孔板，400 μL/孔，每组设3个复孔。在实验结束时，1000 r/m离心5 min，PBS洗涤2遍，弃上清液，分别加入细胞凋亡检测试剂盒中的缓冲液，混匀，再加入AnnexinV/FITC 5 μL、PI 10 μL，混合均匀后，室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测，并应用Cell Quest软件分析计算细胞凋亡率。实验重复3次，取均值。

1.5 各组HepG2细胞凋亡、细胞自噬和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)/核转录因子-κB(NF-κB)相关蛋白表达水平检测 采用Western法检测，取各组处理后的HepG2细胞，提取总蛋白，采用Bradford调整各组蛋白浓度，使其一致，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转至经甲醛预处理过的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人Bax、抗Bcl-2、抗Caspase-3、抗LC3A/B、抗p62、抗p-P13K-p85、抗P13K-p85、抗Akt、抗p-Akt、抗p65、抗p-p65、抗β-actin(1:500)，4℃孵育过夜，用TBST漂洗40 min，加入HRP标记的二抗(1:500)，孵育1 h，用TBST漂洗40 min，加ECL发光液使PVD膜显色，在暗室对X线片曝光，应用Imaging System软件分析条带灰度值。

2 结果

2.1 四组HepG2细胞增殖抑制和凋亡情况比较 实验结果显示紫草素具有显著的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用，且呈剂量依赖性(表1、图1)。

表1 四组HepG2细胞增殖抑制和凋亡比较

与对照组比，①P<0.05；与小剂量紫草素组比，②P<0.05；与中剂量紫草素组比，③P<0.05

2.2 四组HepG2细胞凋亡相关蛋白表达水平比较 经1、2.5和5 μmol/L紫草素处理细胞48 h，细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值和Caspase-3相对表达量显著高于对照组，差异均有统计学差异(P<0.05，表2)。

2.3 四组HepG2细胞自噬相关蛋白表达水平比较 经紫草素处理HepG2细胞48 h，细胞自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I比值显著高于对照组，而p62蛋白相对表达水平显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，表3)。

2.4 四组HepG2细胞PI3K、Akt和NF-κB蛋白表达水平比较 经紫草素处理HepG2细胞48 h，PI3K、Akt和p65蛋白表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，表4、图2)。

图1 四组HepG2细胞凋亡情况 经紫草素处理后，细胞凋亡显著增加，呈剂量依赖性

孔数Bax/Bcl-2Caspase-3 对照组100.6±0.10.18±0.06 小剂量紫草素101.3±0.2①0.45±0.10① 中剂量紫草素102.7±0.3①②0.78±0.16①② 大剂量紫草素108.2±0.6①②③0.95±0.21①②③

与对照组比，①P<0.05；与小剂量紫草素组比，②P<0.05；与中剂量紫草素组比，③P<0.05

表3 四组HepG2细胞自噬相关蛋白表达水平比较

与对照组比，①P<0.05；与小剂量紫草素组比，②P<0.05；与中剂量紫草素组比，③P<0.05

表4 四组HepG2细胞PI3K、Akt和NF-κB蛋白表达比较

与对照组比，①P<0.05；与小剂量紫草素组比，②P<0.05；与中剂量紫草素组比，③P<0.05

图2 四组HepG2细胞PI3K、Akt和NF-κB蛋白表达情况

3 讨论

紫草素作为紫草的主要药效成分，已被证实能够抑制多种肿瘤细胞的生长，但是否能抑制肝癌细胞生长，目前研究较少。本研究结果显示，用不同浓度的紫草素处理人肝癌HepG2细胞48 h后，HepG2细胞增殖均受到显著的抑制，且紫草素浓度越高抑制效果越显著，表明紫草素对肝癌细胞也有抑制作用。本研究使用流式细胞仪分析发现，紫草素处理HepG2细胞后细胞凋亡率显著增高，表明紫草素能够促进肝癌细胞的凋亡。有研究证实紫草素通过使肿瘤细胞阻滞于G0/G1期从而提高细胞凋亡率[8]，而Caspase和Bcl-2基因家族在细胞凋亡过程中发挥着关键的作用，尤其是Caspase-3基因，作为细胞凋亡最为重要的死亡执行蛋白酶，在细胞凋亡的启动和调节过程中均发挥重要的作用[9]。Bax作为Bcl-2基因家族的主要促凋亡成员，能够诱导线粒体通透性发生改变，从而释放细胞色素C，促进细胞凋亡[10]，而Bcl-2则主要通过抑制Caspase-3激活，并抑制Bax的细胞毒性，调节线粒体内钙离子浓度，抑制细胞凋亡。因此，Bax/Bcl-2表达比值常用于体现细胞内凋亡情况[11]。本研究结果发现，经紫草素处理后，细胞内Caspase-3和Bax/Bcl-2比值均显著升高，且呈浓度依赖性，表明紫草素是通过促进HepG2细胞内凋亡关键蛋白的表达，从而促进了细胞凋亡。

细胞自噬作为生物细胞自我降解细胞器再利用的一种调节机制，在细胞正常情况下很少发生，但当细胞处于缺氧、应激及相关刺激环境下时，该过程就会增强[12]。目前，关于促进癌细胞自噬来治疗癌症的研究争议较大，但许多抗癌分子确实能够激活肿瘤细胞的自噬活动，从而将其清除出机体外[13]。LC3和p62是细胞自噬过程的两个标志性蛋白。当细胞自噬发生时，PI3K/Akt信号途径会激活mTOR，促进LC3胞质型(LC3-I)转化为LC自噬体膜型(LC3-II)，同时还会泛素化p62激活细胞的选择性自噬降解[14，15]。本研究结果发现，经紫草素处理48 h后，细胞内LC3-II/LC3-I比例显著升高，p62蛋白表达水平显著降低，并且呈浓度依赖性，表明紫草素能够通过促进LC3转化和p62蛋白泛素化而促进HepG2细胞自噬。同时，我们还检测了细胞PI3K、Akt和NF-κB蛋白的表达情况，发现经紫草素处理后，HepG2细胞内PI3K、Akt和NF-κB蛋白表达水平均显著降低。PI3K/Akt信号通路在机体内主要是通过抑制cmyc诱导的细胞凋亡来促进肿瘤细胞的异常增殖。因此，该通路主要发挥抗凋亡作用。同时，该通路还能够通过磷酸化下游转录因子NF-κB和mTOR来调控细胞凋亡和自噬进程[16]。因此，我们推测紫草素可能是通过抑制PI3K、Akt和NF-κB蛋白的磷酸化，促进了细胞凋亡和自噬途径，从而影响HepG2细胞的活力[17-20]。

综上所述，目前研究发现紫草素的抗肿瘤机制主要集中在其促肿瘤细胞凋亡和坏死。本研究结果发现，紫草素通过调控PI3K/Akt/NF-κB信号通路，影响细胞凋亡和自噬关键蛋白的表达，从而影响细胞活力，证实了紫草素还可能通过调控细胞自噬过程来发挥抗癌作用。因此，紫草素作为天然的抗肿瘤药物，具有很好的临床应用前景，但其在机体内的直接作用靶点尚未研究清楚，还有待深入研究。