宋红艳 夏敬胜 纪刚剑 任章焘 张相林 柳芳 陈灵

摘 要 目的：建立測定人体尿液中5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、马尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺、缬氨酸浓度的方法。方法：采集抑郁症患者的晨尿，加入内标可的松，以乙腈处理后取上清液进行浓缩，采用液相色谱-质谱串联法（LC-MS/MS）进行分析。色谱柱为XTerra RP18;流动相A相为0.1%乙酸-水，流动相B相为0.1%乙酸-乙腈（梯度洗脱）;柱温为40 ℃;流速为0.45 mL/min;采用电喷雾离子源（ESI），以多反应监测方式（MRM）进行定量分析，5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、马尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺、缬氨酸和内标可的松在正离子模式下定量分析离子对分别为质荷比（m/z）192.2→146.1、147.2→130.0、180.1→105.1、161.1→125.2、116.1→70.2、205.2→188.2、138.2→121.1、182.0→123.0、118.2→72.1、361.2→163.0。结果：5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的检测质量浓度范围为10.00～3 200 ng/mL（r=0.993 8～0.998 9，n=6），定量下限为10 ng/mL;色氨酸、酪氨酸、马尿酸的检测质量浓度范围为1 600～51 200 ng/mL（r=0.999 2～0.999 7，n=6），定量下限为1 600 ng/mL，准确度试验结果为86.29%～98.65%（n=6），日内、日间精密度试验的RSD均不高于14.65%（n=6），基质效应的CV为6.18%～14.37%（n=6），提取回收率为86.21%～98.14%（n=6），稳定性试验的RE均<14.71%（n=3～6）。结论：该方法灵敏、准确，可用于测定人体内上述9种物质的浓度。

关键词 抑郁症患者;尿液浓度;液相色谱-质谱串联法;氨基酸类物质

中图分类号 R969 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）01-0091-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.16

ABSTRACT   OBJECTIVE： To establish a method for the determination of 5-hydroxyindole acetic acid （5-HIAA）， glutamine， hippurate， pimelate， proline， tryptophan， tyramine， tyrosine and valine in human urine. METHODS： Morning urine samples were collected from depression patients. The sample was extracted with acetonitrile after addition of internal standard cortisone. LC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on XTerra RP18 column with mobile phase consisted of 0.1% acetic acid-water as mobile phase A and 0.1% acetic acid-acetonitrile as mobile phase B （gradient elution）. The column temperature was set at 40 ℃， and flow rate was 0.45 mL/min. Electrospray ion source （ESI） was used for quantitative analysis by multiple reaction monitoring （MRM）. The precursor/product ion transitions （m/z） were monitored at m/z 192.2→146.1， m/z 147.2→130.0， m/z 180.1→105.1， m/z 161.1→125.2， m/z 116.1→70.2， m/z 205.2→188.2， m/z 138.2→121.1， m/z 182.0→123.0， m/z 118.2→72.1 and m/z 361.2→163.0 （+ion-mode） for 5-HIAA， glutamine， hippurate， pimelate， proline， tryptophan， tyramine， tyrosine， valine and cortisone， respectively. RESULTS： The linear range of 5-HIAA， glutamine， pimelate， proline， tyramine and valine were 10.00-3 200 ng/mL （r=0.993 8-0.998 9， n=6）. The lower limit of quantification was 10 ng/mL; the linear range of hippurate， tryptophan and tyrosine were 1 600-51 200 ng/mL （r=0.999 2-0.999 7， n=6）. The lower limit of quantitation was 1 600 ng/mL. The results of accuracy tests were 86.29%-98.65% （n=6）. RSDs of intra-day and inter-day precision tests were no more than 14.65% （n=6）. CV of matrix effect were 6.18%-14.37% （n=6）. Extraction recovery rates were 86.21%-98.14% （n=6）. RE of stability tests were no more than 14.71% （n=3-6）. CONCLUSIONS： The method is sensitive， accurate and suitable for the determination of 9 substances in human.

KEYWORDS   Depression patients; Urine concentration; LC-MS/MS; Amino acid substances

抑郁症神经生物化学方面的研究是近几十年来的研究的热点，取得了很大的进展，通过对抑郁症临床治疗的有效药物进行研究，几乎所有在临床上有效的抗抑郁剂都能够影响人体内物质含量的变化[1-2]。 目前临床常用抗抑郁药，如三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制药、5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂、 特异性的5-HT和去甲肾上腺素再摄取抑制剂（NERI）等，都围绕增加5-HT、去甲肾上腺素（NE）等发挥抗抑郁作用。然而，现有的抗抑郁药的治疗率低、起效时间长、复发率高等诸多不足引起了研究人员对抑郁症和抗抑郁药的重视。随着代谢组学在抑郁症研究中的广泛应用，抗抑郁药的外周干预机制逐步凸显。以γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）为代表的氨基酸类物质与抑郁症关系的动物实验研究显示，抑郁模型小鼠体内GABA增加是通过谷氨酸脱羧酶65和谷氨酸脱羧酶67两个合成限速酶的增加引起的，从而进一步引起小鼠行为和情感状态的改变[3]。随着研究的进一步深入，许多研究者又提出抑郁症与人体尿液中多种内源性物质相关，包括兴奋性氨基酸物质（例如谷氨酰胺），单胺类物质代谢产物（例如5-羟基吲哚乙酸、色氨酸），NE和5-HT再摄取抑制剂（例如酪胺、酪氨酸）和其他氨基酸（例如脯氨酸、缬氨酸、庚二酸、马尿酸）[4-5]。建立测定尿液中上述内源性物质含量的方法，对研究上述物质与抑郁症的关系具有重要意义。

朱晓伟、马晓丽等[6-7]利用柱前或者柱后衍生法建立了测定氨基酸的含量测定方法;Filee R、Thianthum S等[8-9]将柱后茚三酮衍生联用离子交换色谱法（Ion-exchange chromatography，IEC）广泛地运用于氨基酸的含量测定。虽然上述方法具有良好的分离度、线性范围和重现性，但是，其分析时间较长，尤其对于尿液样本，方法的专属性可能会因为与其余化合物潜在的相互作用而降低。此外，反相高效液相色谱（RP-HPLC）柱后邻苯二甲醛衍生化用于测定氨基酸含量时虽然也分析时间较短及灵敏度较高，但是其样品前处理方法较为复杂[10-12]。

本研究选择将尿液样品经乙腈处理后，采用液相色谱-质谱串联（LC-MS/MS）法测定其中5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、马尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺、缬氨酸的浓度。由于生物内源性的空白样本较难获取，本研究在方法学考察过程中，全部将健康人体尿液样本中氨基酸类内源性物质的本底扣除。经方法学考察，该方法专属、准确、灵敏度高，可用于临床健康人体和抑郁症患者尿液中上述9种内源性物质的含量测定。

1 材料

1.1 仪器

1200高效液相色谱仪，包括G1322A在线脱气机、G1312B泵、G1316B柱温箱、G1367C自动进样器（美国Agilent公司）;API 5500四级杆串联质谱仪，配备电喷雾离子化源（ESI）（美国AB公司）。

1.2 药品与试剂

5-羟基吲哚乙酸对照品（批号：TGECA-MI，纯度：>98%）、马尿酸对照品（批号：L4UOB-EC，纯度：>98%）、庚二酸对照品（批号：FIMO1-QDIT，純度：>98%）、酪胺对照品（批号：LDVVF-AP，纯度：>98%）、色氨酸对照品（批号：6XHKM-ON，纯度：99%）均购自中国TCI试剂公司;脯氨酸对照品（批号：A02130623，纯度：99%）、酪氨酸对照品（批号：A02131107，纯度：98.5%）、缬氨酸对照品（批号：A02131208，纯度：99%）均购自思域化工科技有限公司;谷氨酰胺对照品（阿拉丁试剂公司，批号：J1318016，纯度：99%）;可的松（内标，中国食品药品检定研究院，批号：101128-201001，纯度：97.2%）;甲醇、乙腈（美国Tedia公司，色谱纯）;水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 尿液样本

本研究选取抑郁症患者和健康受试者各6例，分别采集其晨尿。所有抑郁症患者均符合以下条件：（1）符合《中国精神障碍分类与诊断标准》第3版（CCMD-3）中关于抑郁症的诊断标准[13];（2）汉密尔顿抑郁量表HDRS评分为17～≤28分;（3）年龄18～60岁;（4）排除脑器质性疾病、严重躯体疾病、药物滥用和药物过敏者，以及青光眼、内分泌疾病及严重自杀企图者;（5）既往无药物服用史。所有健康受试者（18～60岁）和抑郁症患者的心电图、胸片检查、血生化、血常规、尿常规及免疫学检查结果均正常。本研究方案已经通过武汉市第三医院伦理委员会的论证，受试者均签署书面知情同意书。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与质谱条件

色谱柱：XTerra RP18（100 mm×3.91 mm，3.5 ?m）;流动相A：0.1%乙酸-水，流动相B：0.1%乙酸-乙腈，梯度条件：0～1 min 99%A，1～9 min 99%→68%A，9～11 min，68%→1%A，11～14 min 1%A;流速：0.45 mL/min;进样量：5 μL;柱温：40 ℃;进样器温度：4 ℃。

采用电喷雾离子源（ESI），以多反应监测方式（MRM）正离子模式进行定量分析，源喷射电压：5.5 kV，雾化温度：500 ℃，雾化气（N2）压力：20 psi，辅助气（N2）压力：10 psi，气帘气（N2）压力：20 psi。9种待测物和内标的质谱参数见表1，二级质谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液 精密称取5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、马尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺、缬氨酸对照品适量，分别置于量瓶中，加2%甲酸-水 ∶ 甲醇 （90 ∶ 10，V/V）溶解并定容，制成质量浓度均为1.000    mg/mL的对照品贮备液。

2.2.2 内标溶液 精密称取可的松对照品适量，置于量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成质量浓度为30.02 mg/mL的内标溶液。

2.3 尿液样品的处理

精密吸取尿液上清液200 μL，置于1.5 mL EP管中，精密加入内标溶液20 μL，涡旋30 s，再加入200 μL的乙腈，涡旋60 s，于4 ℃下6 000×g离心10 min，吸取上清液1.5 mL，置于EP管中，于40 ℃下氮气吹干，残渣用100  μL 10%甲醇水溶液溶解，于4 ℃下6 000×g离心10 min，取上清液进样分析。

2.4 专属性试验

取同一例临床抑郁症患者尿液6份，按“2.3”项下方法处理后进样分析，在该条件下，谷氨酰胺、脯氨酸、缬氨酸、酪胺、酪氨酸、色氨酸、庚二酸、马尿酸、5-羟基吲哚乙酸和内标可的松的保留时间依次为2.01、2.11、2.33、4.42、4.72、7.40、8.80、8.90、9.11、12.01 min，LC-MS/MS图见图2。

2.5 线性关系和定量下限考察

精密量取“2.2.1”项下一系列对照品贮备液，分别以健康受试者尿液上清液稀释，制成下列质量浓度的对照品混合工作液，其中5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的质量浓度分别为10.00、25.00、100.00、200.00、400.00、1 600、3 200 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、马尿酸的质量浓度分别为1 600、3 200、6 400、12 800、25 600、51 200 ng/mL，按“2.3”项下方法处理后进样分析，记录峰面积。另取已知含量的健康受试者尿液200 μL，加入200 μL乙腈，涡旋60 s，于4 ℃下6 000×g离心10 min，取上清液，于40 ℃下氮气吹干，再用100    μL 10%甲醇水复溶，6 000×g离心10 min，取上清液进样分析，记录内源性峰面积。以加入对照品的质量浓度为横坐标（x），加入对照品后的峰面积减去内源性峰面积之差与内标峰面积的比值为纵坐标（y），绘制标准曲线。9种待测物的线性关系和定量下限结果见表2。

2.6 准确度试验

精密量取“2.2.1”项下一系列对照品贮备液，分别以健康受试者尿液稀释，制成3个质量浓度的溶液，每个浓度制备6份，其中5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的质量浓度分别为20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、马尿酸的质量浓度分别为2 000、10 000、50 000 ng/mL，按“2.3”项下方法处理后进样分析，以测定值/标示值×100%计算准确度。结果显示，9种待测物的准确度在86.29%～98.65%之间，均符合相关规定。准确度试验结果见表3。

2.7 精密度试验

精密量取“2.2.1”项下一系列对照品贮备液，以健康受试者尿液上清液稀释，制成3个质量浓度的溶液，其中5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的质量浓度分别为20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、马尿酸的质量浓度分别为2 000、10 000、50 000 ng/mL，按“2.3”項下方法处理后进样分析，每个浓度样品日内测定6份，连续测定6 d，记录峰面积，计算日内、日间精密度。结果显示，9种待测物的日内、日间RSD均不高于14.65%（n=6），均符合相关规定。精密度试验结果见表4。

2.8 基质效应考察

取流动相200 μL，加入200 μL乙腈，涡旋60 s，于4 ℃下6 000×g离心10 min，取上清液，分别加入3个质量浓度的混合对照品溶液100 μL（5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的质量浓度分别为20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、马尿酸的质量浓度分别为2 000、10 000、50 000 ng/mL）和内标溶液20 μL，每个浓度制备6份，吸取上清液于1.5 mL EP管中，于40 ℃下氮气吹干，再用100 μL 10%甲醇水复溶，6 000×g离心10 min，取上清液进样分析，记录峰面积A1。另取已知含量的健康受试者尿液上清液200 μL，按上述方法操作记录峰面积A2。再取已知含量的健康受试者尿液200 μL，加入200 μL乙腈，涡旋60 s，于4 ℃下6 000×g离心10 min，取上清液，于40 ℃下氮气吹干，再用100 μL 10%甲醇水复溶，6 000×g离心10 min，取上清液进样分析，记录峰面积A3。以（A2-A3）/A1×100%计算基质效应。结果显示，9种待测物基质效应的CV均<15%，均符合相关规定，基质效应考察结果见表5。

2.9 提取回收率试验

取已知分析物含量的健康受试者尿液200 μL，分别加入3个质量浓度的混合对照品溶液100 μL（5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的质量浓度分别为20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、马尿酸的质量浓度分别为2 000、10 000、50 000 ng/mL）和内标溶液20 μL，每个浓度制备6份，涡旋30 s，加入200 μL乙腈，涡旋60 s，于4 ℃ ，6 000×g离心10 min，取上清液于1.5 mL离心管中，于40 ℃下氮气吹干，再用100 μL 10%甲醇水复溶，6 000×g离心10 min，取上清液进样分析，记录峰面积A4。再分别取已知含量的健康受试者尿液200 μL，按“2.8”项下方法操作，记录峰面积A2和A3。以（A4-A3）/A2×100%计算提取回收率。结果显示，9种待测物提取回收率为86.21%～98.14%，RSD为4.14%～14.29%，均符合相关规定，提取回收率试验结果见表6。

2.10 稳定性试验

2.10.1 室温稳定性 取同一份已知含量的健康人体尿液上清液，分别加入不同质量浓度的混合对照品溶液，分别制成3个质量浓度的溶液，每个浓度制备3份，其中5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的质量浓度分别为20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、马尿酸的质量浓度分别为2 000、10 000、50 000 ng/mL，分别在室温下放置0、3、6、9、12 h后，按“2.3”项下方法处理后进样分析，计算测定值与标示值的RE。结果显示，9种待测物的RE均<14.71%（n=5），均符合相关规定。

2.10.2 处理后稳定性 取同一份已知含量的健康人体尿液上清液，分别加入不同质量浓度的混合对照品溶液，分别制成3个质量浓度的溶液，每个浓度制备3份，其中5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的质量浓度分别为20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、马尿酸的质量浓度分别为2 000、10 000、  50 000 ng/mL，按“2.3”项下方法处理后，在室温下放置0、3、6、9、12、24 h，再按“2.1”项下条件进样分析，计算测定值与标示值的RE。结果显示，9种待测物的RE均<14.21%（n=6），均符合相关规定。

2.10.3 冻融稳定性 取同一份已知含量的健康人体尿液上清液，分别加入不同质量浓度的混合对照品溶液，分别制成3个质量浓度的溶液，每个浓度制备3份，其中5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的质量浓度分别为20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、马尿酸的质量浓度分别为2 000、10 000、50 000 ng/mL，连续-20 ℃冷冻、室温融化3次后，再按照“2.3”项下方法处理后进样分析，计算测定值与标示值的RE。结果显示，待测物的RE均<13.25%（n=3），均符合相关规定。

2.10.4 长期稳定性 取同一份已知含量的健康人体尿液上清液，分别加入不同质量浓度的混合对照品溶液，分别制成3个质量浓度的溶液，每个浓度制备3份，其中5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的质量浓度分别为20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、马尿酸的质量浓度分别为2 000、10 000、50 000 ng/mL，于-20 ℃下分别冻存1、15、30 d后，再按照“2.3”项下方法处理后进样分析，计算测定值与标示值的RE。结果显示，9种待测物的RE均<14.52%（n=3），均符合相关规定。

2.11 应用

按本文方法分别测定6例抑郁症患者晨尿中的5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、马尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺和缬氨酸的含量，结果见表7。

3 讨论

生物体内内源性物质由于浓度极低、干扰物质多，一直是定量分析的难点。经典的离子交换法和柱后衍生法也存在一些固有不足，如检测时间长、前处理过程烦琐、条件限制较多、干扰物质多。LC-MS/MS法具有普适性好、分析时间短，且可以同时检测多种内源性物质的特点，在内源性物质的体内含量分析中发挥着重要的作用。然而，现有的测定内源性物质的LC-MS/MS法，通常需要使用昂贵的不含有内源性物质的特殊介质或者忽略基质效应，直接采用对照品溶液进行方法学考察。另一方面，由于仪器灵敏度限制，许多內源性物质的LC-MS/MS法样品前处理方法烦琐、耗时长、费用高。

5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、马尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺和缬氨酸是人体尿液中的内源性物质，含量低，与临床多种疾病紧密相关。本文建立了LC-MS/MS法测定抑郁症患者尿液中5-羟基吲哚乙酸、谷氨酰胺、马尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺和缬氨酸的浓度，采用扣除内源性物质本底的方法进行方法学考察，对于其他生物内源性物质的定量测定具有借鉴意义，同时该检测方法样本采用直接沉淀法，操作十分便捷。

综上所述，本方法灵敏度高、重现性好、回收率高，可用于人体尿液中上述9种内源性物质的定量检测。

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（收稿日期：2019-09-23 修回日期：2019-11-10）

（编辑：邹丽娟）