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余甘子提取物对非酒精性脂肪性肝病大鼠外周血Treg细胞及肝组织LXRα/FAS通路表达的影响*

2020-07-09胡亦懿翟英姬梅迪华张志侨罗晓亮黄燕峰杜国平

实用肝脏病杂志 2020年4期
关键词:提取物剂量蛋白

胡亦懿,翟英姬,梅迪华,张志侨,罗晓亮,黄燕峰,杜国平

随着肥胖、糖尿病和代谢综合征患病率不断攀升,非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)正成为一个新的健康挑战[1,2]。免疫功能失衡参与各种疾病的发生发展,其在NAFLD发病机制中起着重要作用[3,4]。余甘子(PhyllanthusemblicaL.)富含超氧化物歧化酶、维生素C、多酚类和多糖等活性物质,除具有强烈的抗氧化活性外,还具有抗炎症、抗流感、抗高血压、抗肿瘤和护肝等功效[5,6]。本研究采用NAFLD大鼠模型,予以不同剂量的余甘子提取物干预,观察了余甘子提取物对NAFLD大鼠外周血Treg细胞及肝组织LXRα/FAS通路的影响,以期为中医临床治疗NAFLD提供理论依据和新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 48只健康SD大鼠,体质量为180~220 g,购于成都硕达实验动物有限公司【生产许可证号:SCXK(川)2015-030,使用许可证号:SYXK(川)2014-189】。多烯磷脂酰胆碱购于赛诺菲北京制药有限公司(批号:6BJD136),余甘子提取物购于西安维特生物科技有限公司(含40%多酚),检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素17(IL-17)、白介素10(IL-10)的ELISA试剂盒购于上海茁彩生物科技有限公司,检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)血生化试剂盒购于上海茁彩生物科技有限公司,抗LXRα购于美国SantCruz公司,抗FAS购于美国Cell Signaling Technology,自动生化分析仪购于日本日立公司,FACSCalibur流式细胞仪购于美国BD公司。

1.2 大鼠NAFLD模型的构建 适应性喂养大鼠1 w,随机将其分为对照组、模型组、多烯磷脂酰胆碱组及小剂量、中等剂量和大剂量余甘子提取物处理组,每组8只。给予造模大鼠高脂饲料喂养连续12 w,给予对照组普通饲料喂养。12 w后,随机取造模组动物3只行肝组织病理学观察。在造模后第2天,分别给予对照组和模型组大鼠0.9% NaCl、多烯磷脂酰胆碱组大鼠多烯磷脂酰胆碱150 mg·kg-1、小、中、大剂量组大鼠余甘子提取物80 mg·kg-1、160 mg·kg-1、400 mg·kg-1灌胃,1次/d,连续给药6 w。 在给药结束后,给予10 %水合氯醛腹腔注射麻醉,经腹主动脉取血5 mL,其中1 mL加入抗凝管,立即进行后续流式细胞检测;另外4 mL静置后离心分离血清,-80 ℃冰箱保存。迅速摘取肝脏,0.9% NaCl溶液冲洗,滤纸吸干,取肝右叶新鲜组织,一部分经4%多聚甲醛固定,剩余部分置于-80℃超低温冰箱保存,用于后续检测。将固定的肝脏组织按常规方法制备石蜡切片,HE染色,镜检观察。肝脏病变评分参考2010年版《非酒精性脂肪性肝病诊断指南》(修订版)和《美国国立卫生研究院发布的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)临床研究网病理工作组指南》进行评分[7],评分标准为脂肪变性:<5%记0分,5%~33%记1分,34%~66%记2分,>67%记3分;小叶炎症:无病灶记0分,1~2个病灶/视野(×20)记1分,2~4个病灶/视野(×20)记2分,>4个病灶/视野(×20)记3分;气球样变:无记0分,少记1分,多记2分。

1.3 血清指标检测 采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-17和IL-10水平。

1.4 免疫功能指标检测 取抗凝血1 mL,加入流式测定管,分别加入FITC标记的抗CD4 McAb 5 μL、PE标记的抗IL-17 McAb 5 μL或FITC标记的抗CD4 McAb 5 μL、PE标记的抗CD25 McAb 5 μL混匀,避光孵育约20 min,加溶血素2 mL,避光孵育约10 min,1200 r/m离心5 min,弃上清液,加PBS洗2遍,弃上清液,加入PBS缓冲液,调整细胞数至1×106个细胞/mL,于FACSCalibur 流式细胞仪检测。CD4+IL-17+为Th17细胞,CD4+CD25+为Treg细胞数。

1.5 肝组织LXRα和FAS蛋白表达检测 采用WB法检测肝组织LXRα和FAS蛋白表达,用RIPA裂解液提取肝组织总蛋白,以BCA法行蛋白质定量,并用蛋白上样缓冲液(5×)变性样品,于-20℃保存备用。使用等量蛋白质上样,选择10% SDS-PAGE进行分离,将分离后的蛋白质转移至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入抗LXRα、抗FAS、抗β-actin,均按1: 500稀释,4℃孵育过夜,TBST清洗。根据一抗来源,选择合适的二抗(稀释比为1: 5000),室温孵育1 h,TBST清洗,ECL暗室显色。应用Bio-Rad全功能成像系统采集图像,应用Image-ProPlus分析光密度,以β-actin为内参,以阴性对照的目标蛋白相对含量为1,计算各组蛋白质的相对表达量,实验重复3次。

2 结果

2.1各组大鼠肝组织病理学表现 见图1。

2.2 各组大鼠血清细胞因子水平变化的比较 见表1。

2.3 各组大鼠全血CD4+IL-17+和CD4+CD25+Treg细胞百分比比较 模型组血CD4+IL-17+细胞百分比为(1.9±0.4)%,显著高于对照组[(0.3±0.2)%,P<0.05],而大剂量余甘子处理组血CD4+IL-17+细胞较模型组显著降低(P<0.05,图2A和图2B);模型组CD4+CD25+Treg细胞百分比较对照组显著降低(P<0.05),小、中、大剂量余甘子提取物处理组CD4+CD25+Treg细胞显著升高(P<0.05,图2A和图2C)。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现(H&E,400×)a:对照组;b:模型组;c:多烯磷脂酰胆碱处理组;d:小剂量组;e:中剂量组f:大剂量余甘子处理组

表1 各组大鼠血清细胞因子水平比较

与对照组比,①P<0.05;与模型组比,②P<0.05

图2 各组大鼠外周血Th17和Treg细胞百分比比较A:各组流式细胞检测表现;B:各组大鼠血Th17细胞数比较;C:各组大鼠血Treg细胞数比较与对照组比,**P<0.01;与模型组比,#P<0.05,##P<0.01

2.4 各组大鼠肝组织LXRα和FAS蛋白表达比较 与对照组比,模型组肝组织LXRα和FAS蛋白相对表达量分别为(1.8±0.1)和(2.0±0.2),均显著升高(P<0.05);小、中、大剂量余甘子提取物处理组肝组织LXRα和FAS蛋白表达显著降低(P<0.05,图3)。

图3 各组大鼠肝组织LXRα和FAS蛋白表达强度比较

3 讨论

在我国,许多中药治疗NAFLD的临床疗效显著,其中一些中药已对其分子生物学机制进行了研究【8-11]。余甘子已被证明是具有护肝功效的药物[5]。多烯磷脂酰胆碱胶囊可通过调节NAFLD小鼠模型Treg/Th17细胞和相关的分泌因子平衡,抑制小鼠模型炎症反应,防止脂肪肝的发生发展[12]。本研究组织病理学观察结果显示余甘子提取物可明显改善NAFLD模型大鼠肝组织病理学变化。

研究表明Th17细胞在NAFLD动物模型的肝脏和外周血中大量存在[13,14]。Th17细胞可通过正反馈机制,刺激脂肪细胞、巨噬细胞和单核细胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性因子来参与脂肪组织的炎症[15,16]。Treg细胞特异性转录活化因子为叉头状转录因子3(Foxp3),发挥免疫调控作用,防止对自身抗原的自身反应性,并在感染诱导的免疫反应中避免效应器T细胞的过度激活和随后的组织损伤[17],肝脏Treg细胞数量减少,Treg细胞与Th17细胞在机体相互拮抗,维持机体免疫炎症平衡[18]。本实验结果显示大剂量余甘子提取物能明显降低血清IL-17和TNF-α,明显增加IL-10水平。余甘子提取物能够调节Treg/Th17细胞比例失调,防止NAFLD大鼠肝脏病变的发生发展[19]。FAS是LXRα的下游基因,能激活FAS的转录,可调控机体脂质代谢[20]。本实验结果显示余甘子可明显降低模型组LXRα和FAS蛋白表达,调节脂质代谢。

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