程曦 刘丽虹 刘进峰 高亚琪

摘要    为减少阿维菌素菌种筛选的工作量，缩短筛选时间，提高筛选效率，本文对阿维菌素菌种单菌落效价进行测定，用单菌落效价初步表达菌株的产抗能力，探索固态下单菌落效价与液态下摇瓶效价的相关性。结果表明，阿维菌素菌种固态下产抗能力和液态下产抗能力正关联，相关系数r=0.924。可以只对菌落效价高的菌株做进一步的摇瓶培养及效价测定，减少筛选工作量，提高筛选效率。

关键词    阿维菌素菌种;单菌落;筛选;效价测定

中图分类号    TQ453        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）12-0129-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

阿维菌素（avermectins，AVMs）是由阿维链霉菌（Strept-omyces avermitilis）代谢产生的一种效果极佳的大环内酯类杀螨杀虫剂和潜在的抗生素药物[1]。其作用机制独特，与其他抗寄生虫药物无交叉耐药性，毒性低、无残留[2]。阿维链霉菌发酵液中通常含有8种阿维菌素组分，即A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b，其中B1組分，尤其是B1a组分的杀虫效果最佳，目前B1a组分也是商品化阿维菌素产品的主要成分[3-4]。在近20年的阿维菌素工业化生产中，通过菌种筛选、发酵配方和控制工艺的不断优化，发酵水平不断提高，特别是中国科学院微生物研究所引进合成生物学技术，将阿维菌素单位产量提高1 000倍，至9 g/L[5]。然而，当下阿维菌素的生产中仍然存在生产稳定性差、高消耗、高污染、片面追求生产规模的粗放发展等问题，若要从根本上解决这些问题，就需要对阿维菌素的生产菌种——阿维链霉菌进行持续的改良筛选。

诱变筛选是进行阿维链霉菌改良的主要方法。阿维链霉菌菌株经过诱变处理后，正变异率极低。传统的筛选方法是根据单菌落外观（如形状、颜色）挑选单菌落并进行后续培养及液态下的摇瓶效价测定。该方法存在随机性强、筛选工作量大以及耗时长等问题。如果测定固态下的单菌落效价，用单菌落效价表达菌株产能，就避免了大量的斜面培养、种子瓶培养和发酵瓶培养操作过程，可以极大地减少工作量，提高筛选效率。采用该方法时需要解决的一个关键问题是阿维链霉菌在固态发酵产生效价时，其在摇瓶培养中是否产生效价，如果产生，2种情况下效价的关联程度如何。例如，日本明治制果公司曾从土壤中分离出放线菌，并对其在固态和液态下的产抗能力（即效价）做了相关统计。结果显示，在将这些固态发酵中有抗菌活性的1 300株菌种，再做液态发酵培养有活性的占1 275株，而25株在液态发酵时变得无抗菌活性[6]。阿维链霉菌属于放线菌的一种，其在固态菌落发酵和液态培养瓶发酵存在一定的差别，目前关于阿维链霉菌在固态发酵和液态发酵下所产生效价之间的关联性尚不明确。

基于上述研究背景，本文对阿维菌素菌种——即阿维链霉菌在固态发酵和液态发酵下所产生效价之间的关联性进行系统研究，进而有助于根据固态下的单菌落效价对菌株进行初步筛选，以达到减少阿维菌素菌种筛选工作量和提高筛选效率的目的。

1    材料与方法

1.1    试验材料

1.1.1    菌株。试验菌株为河北兴柏农业科技有限公司生产用菌种AV-37。

1.1.2    培养基。①单菌落及斜面孢子。组分为葡萄糖15 g/L、牛肉粉3 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、天冬氨酸0.5 g/L、琼脂粉25 g/L。培养条件为温度28～29 ℃，时间10～12 d。②摇瓶种子。组分为玉米淀粉25 g/L、黄豆饼粉8 g/L、花生饼粉10 g/L、酵母膏4 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钴0.01 g/L。培养条件为摇床转速220 r/min，温度28～29 ℃，时间45～50 h。③摇瓶发酵。组分为玉米淀粉140 g/L、淀粉酶0.6 g/L、豆饼粉25 g/L、酵母粉10 g/L、轻质碳酸钙0.5 g/L、硫酸铵0.25 g/L、氯化钴0.02 g/L、钼酸钠0.02 g/L、硫酸锰0.01 g/L。摇瓶装量40 mL，接种量2 mL，培养条件为温度27～28 ℃，转速220 r/min，时间12 d。

1.2    试验方法

1.2.1    单菌落制备及培养。生产用斜面孢子作为出发菌株。将20 mL无菌水加入茄子瓶中，用接种环刮下孢子做成孢子悬浮液。取7 mL孢子悬浮液，加入到放置有磁力搅拌棒的规格为90 mm×15 mm的培养皿中，在磁力搅拌的作用下（转速100 r/min），进行UVC波段（254 nm）间歇照射30 min（20 min+10 min）。取照射后的悬液1 mL进行梯度稀释，分别取10-4～10-3稀释液0.2 mL，与0.3 mL浓度为0.5 mol/L的氯化锂溶液混合，涂于无菌双碟培养基上，用牛皮纸包裹，在28～29 ℃条件下倒置培养至第4～5天，用无菌牙签有选择地将原菌落（An）接种至另一支双碟培养基中，并做好相应的标识，继续培养至11 d。