刘 苏，蒋兴川，蒋秀云，陈 诚，孙劲超，沈怿丹，李桂亭，操海群*

(1.作物有害生物综合治理安徽省重点实验室，植物病虫害生物学与绿色防控安徽普通高校重点实验室，安徽农业大学植物保护学院，合肥 230036；2.安徽审计职业学院，合肥 230601)

昆虫依靠灵敏的嗅觉系统识别外界环境中的信息化合物。当气味分子进入昆虫触角上的嗅觉感器后，首先被气味结合蛋白(odorant-binding proteins，OBPs)所识别，OBPs携带这些疏水性的气味分子穿越感器淋巴液，将气味分子运输至感器深处的气味受体(odorant receptors，ORs)附近，从而激活ORs，引导昆虫产生行为反应(杜立啸等, 2016; 张玉等, 2019)。在鳞翅目昆虫的OBP家族中，有一类能结合性信息素的特殊类群，称为性信息素结合蛋白(pheromone-binding proteins，PBPs)。首个PBP(ApolPBP1)在多音天蚕Antheraeapolyphemus雄蛾触角中被发现，该蛋白能够结合多音天蚕的性信息素组分E6, Z11-16Ac、E6, Z11-16Ald和E4, Z9-14Ac(Vogt and Riddiford, 1981; Lealetal., 2005)。随后，在多种鳞翅目昆虫中都发现有PBPs的存在(Britoetal., 2016)。PBPs是一类小分子水溶性蛋白，其序列中的6个半胱氨酸残基能够形成3对二硫键，从而稳定PBPs蛋白的三维结构(Sunetal., 2018)。此外，PBPs蛋白一般具有6个α-螺旋结构，这些α-螺旋形成结合腔，在PBPs运输性信息素分子中起重要作用(张玉等, 2019)。

绝大多数鳞翅目昆虫如家蚕Bombyxmori、斜纹夜蛾Spodopteralitura、小菜蛾Plutellaxylostella和二化螟Chilosuppressalis等触角中都表达多个PBPs，这些PBPs能够结合本物种不同种类的性信息素组分，在性信息素通讯中扮演重要角色(Gongetal., 2009; Changetal., 2015; Fengetal., 2015; Yangetal., 2017)。此外，在舞毒蛾Lymantriadispar、桃蛀螟Conogethespunctiferalis和茶尺蠖Ectropisobliqua等昆虫中还发现PBPs不仅能结合性信息素，还能结合植物挥发物(贾小俭等, 2015; Yuetal., 2018; Sunetal., 2019)。

由于PBPs与性信息素分子的结合是昆虫性信息素通讯的第一步，因此PBPs可以作为潜在的靶标，用于开发新型的害虫无公害防治技术。目前，RNA干扰技术和基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术已成功应用于沉默或敲除棉铃虫、舞毒蛾、斜纹夜蛾和二化螟等的PBPs基因，使试虫对性信息素的电生理反应显著降低(Zhuetal., 2016; Yeetal., 2017; Yuetal., 2018; Dongetal., 2019)。此外，有研究人员基于PBP蛋白的结构开发了高通量的化合物筛选程序，并成功获得了具有生物活性的引诱剂(Tianetal., 2016)。

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda属鳞翅目夜蛾科，是一类杂食性、暴发性害虫。此虫原产美洲，自2016年在非洲被发现以来，不仅迅速扩撒至撒哈拉以南数十个国家，而且向亚洲入侵，2019年1月此虫被确认入侵我国云南省，截至2019年10月，已确认入侵我国26个省、市、自治区(郭井菲等, 2019; 姜玉英等, 2019; 王磊等, 2019)。草地贪夜蛾在完成初始定殖过程后，预计2020年将进入暴发为害阶段(吴孔明, 2020)。此虫食性杂、食量大、繁殖力强且迁飞距离远，对我国粮食安全造成严重威胁(齐国君等, 2019; 吴益东等, 2019; 闫文娟等, 2019; 杨普云等, 2019)。明确草地贪夜蛾识别性信息素的分子机制，对于寻找新的靶标、筛选高效引诱剂或嗅觉阻断剂应用于害虫防治，均具有重要意义。目前，草地贪夜蛾的性信息素成分已被探明(Unbehendetal., 2013; 江南纪和王琛柱, 2019)，应用性信息素防治草地贪夜蛾也有相关报道(杨留鹏等, 2020)，但关于其性信息素通讯分子机制的研究依然匮乏。本实验从草地贪夜蛾中克隆了4个编码PBPs的cDNA序列(SfruPBP1-SfruPBP4)，并分析了4个SfruPBPs的序列特征、基因组位置、外显子-内含子结构以及组织表达模式。本研究结果为阐明PBPs在草地贪夜蛾性信息素识别中的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验试虫

草地贪夜蛾幼虫采集自安徽省黄山市黄山区玉米田(蒋兴川等, 2019)。将幼虫带回实验室，在人工气候箱中饲养。幼虫饲喂新鲜玉米叶片直至化蛹，羽化后的成虫饲喂10%蜂蜜水。饲养条件为：温度26±1℃，相对湿度70%±10%，光暗周期14 h ∶10 h。

1.2 组织收集、总RNA提取与第一链cDNA合成

收集羽化后48 h之内未交配的雌、雄成虫，置于冰上10 min后，分离收集不同组织：触角、去除触角的头部、胸、腹、足和翅。使用RNAiso Plus试剂(宝生物，大连)提取各组织的总RNA。总RNA样品经琼脂糖电泳分析和NanoDrop 2000微量分光光度计检测后，使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反转录试剂盒(东洋纺，日本)合成第一链cDNA。

1.3 同源检索与基因克隆

从GenBank数据库下载夜蛾科昆虫(斜纹夜蛾S.litura、棉铃虫H.armigera、甜菜夜蛾S.exigua和小地老虎Agrotisipsilon)的PBPs蛋白序列，以此为模板，利用BioEdit软件中的TBLASTN程序在草地贪夜蛾转录组(Legeaietal., 2014)中检索，获得了草地贪夜蛾4个编码PBPs的cDNA序列(SfruPBP1-SfruPBP4)。据此设计基因特异性引物(表1)，使用KOD FX DNA聚合酶(东洋纺，日本)扩增完整开放阅读框。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的条带回收，连入pTOPO-Blunt载体(艾德莱生物，北京)，转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞(全式金，北京)，挑取阳性克隆测序(通用生物，滁州)。

1.4 序列分析与进化树构建

利用DNAstar软件中的EditSeq模块将4个SfruPBPs的核酸序列翻译成蛋白序列，并计算蛋白分子量和等电点。使用Clustal Omega程序进行多序列连配。分泌信号肽使用SignalP 5.0软件预测。根据已报道的草地贪夜蛾基因组序列(Liuetal., 2019)，使用Splign程序分析4个SfruPBPs在基因组上的位置以及外显子-内含子结构。从GenBank数据库下载鳞翅目昆虫的PBPs蛋白序列，利用MEGA 7.0软件以最大似然法(maximum likelihood)构建进化树，并经1 000次Bootstrap自举重复检验。

1.5 组织表达模式分析

使用反转录PCR(RT-PCR)分析4个SfruPBPs在草地贪夜蛾不同组织中的表达模式。所用引物见表1，以草地贪夜蛾核糖体蛋白RpL18作为内参基因。PCR酶为2 × Taq Mix(康为世纪，北京)，反应体系20 μL，包括10 μL 2 × Taq Mix、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、1 μL(10 ng)第一链cDNA和8 μL ddH2O。反应程序为94℃ 2 min，1个循环；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带的分子量是否与预期一致，并经测序确认。

使用实时荧光定量PCR分析SfruPBPs在雌雄触角中的相对表达水平。所用引物见表1，所用仪器为美国Bio-Rad公司CFX96型实时荧光定量PCR仪。反应体系20 μL，包括SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL(东洋纺，日本)、上下游引物各0.5 μL、第一链cDNA 1 μL(10 ng)和8 μL ddH2O。反应程序为95℃ 2 min，1个循环；95℃ 10 s，60℃ 25 s，40个循环。反应完成后，温度从60℃逐步上升至95℃，绘制熔解曲线，以检测是否存在非特异性扩增及引物二聚体。为探测潜在的污染，每个反应板均包含无cDNA模板的对照和无反转录酶的对照。实验设3次生物学重复，基因相对表达量使用2-△△Ct法计算(曹苗苗等, 2018; 董婉莹等, 2019)。

1.6 数据统计

使用DPS数据处理系统软件v9.5版进行数据统计，采用学生氏t测验比较不同样本之间的差异显著性，显著性水平设为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 SfruPBPs序列分析

通过检索草地贪夜蛾转录组，并经过PCR扩增和测序，获得了4个编码PBPs的cDNA序列，命名为SfruPBP1-SfruPBP4(已提交至GenBank数据库，登录号为MN541407-MN541410)。4个SfruPBPs的开放阅读框介于495 bp～621 bp之间，编码的蛋白质长度介于164～206个氨基酸之间(表2)。BLASTX比对结果表明，SfruPBP1和SfruPBP4编码的蛋白分别与斜纹夜蛾PBP1和PBP4的一致性最高，而SfruPBP2和SfruPBP3编码的蛋白分别与甜菜夜蛾PBP2和PBP3的一致性最高(表2)。但4个SfruPBPs编码的蛋白之间的氨基酸一致性较低，介于25%～51%之间(表3)。

表2 4个SfruPBPs的BLASTX最佳匹配

表3 4个SfruPBPs蛋白之间的氨基酸一致性(%)

图1 4个SfruPBPs蛋白序列连配Fig. 1 Alignment of the protein sequences of four SfruPBPs注：蛋白序列中的6个保守的半胱氨酸残基以灰色背景突出显示，并标注数字1～6。灰色方框中的小写字母表示碱基，大写字母表示其编码的氨基酸残基。斜线表示内含子插入位点。内含子1插入在编码两个氨基酸的密码子之间，内含子2插入在编码同一个氨基酸的密码子内部。Note：Six positionally conserved cysteines in the protein sequences are highlighted with grey color and marked with numbers 1 to 6. The lowercase letters in the grey boxes represent nucleotides, while uppercase letters represent the deduced amino acids. The slash indicates the intron insertion site. The intron 1 is inserted between two codons, while intron 2 splits a condon.

4个SfruPBPs蛋白的氨基端(N-端)均预测出一段分泌信号肽，暗示它们可能会被分泌出细胞外(图1)。多序列连配结果表明，4个SfruPBPs蛋白序列中均具有6个保守的半胱氨酸位点。此外，SfruPBP4蛋白的羧基端(C端)显著长于其它3个SfruPBPs(图1)。基于鳞翅目昆虫PBPs的蛋白序列构建了进化树(图2)，结果显示，草地贪夜蛾SfruPBPs与斜纹夜蛾SlituPBPs和海灰翅夜蛾SlittPBPs亲缘关系最近。此外，4个SfruPBPs分别位于不同的进化分支之中，暗示它们可能具有功能上的分化(图2)。

2.2 基因结构分析

使用Splign程序将4个SfruPBPs的cDNA序列与草地贪夜蛾的基因组DNA序列进行连配。结果显示，4个SfruPBPs均位于10号染色体上(chr10)，呈串联排列，序列跨度为8 272 bp(图3A)。SfruPBP1、SfruPBP2、SfruPBP3和SfruPBP4在基因组上的长度分别为688 bp、1 490 bp、800 bp和1 099 bp，均包含3个外显子和2个内含子(图3B)。4个SfruPBPs的内含子边界均符合典型的真核生物“GT-AG”规则(数据未显示)。此外，4个SfruPBPs均具有保守的内含子插入位点，第1个内含子插入在编码两个氨基酸的密码子之间，而第2个内含子插入在编码同一个氨基酸的密码子内部(图1)。

2.3 组织表达模式分析

RT-PCR结果表明，4个SfruPBPs具有不同的组织表达模式。SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3均在雌雄成虫触角中高量表达，而在头、胸、腹、足、翅等非嗅觉组织中不表达(图4)。SfruPBP4却表现出截然不同的表达模式，即在雄成虫腹部表达，而在触角和其它组织中不表达(图4)。使用实时荧光定量PCR进一步检测了SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3在雌雄成虫触角中的相对表达水平(因SfruPBP4在触角中不表达，故未检测)。结果显示，SfruPBP1和SfruPBP2在雄成虫触角中的表达水平显著高于雌成虫(P<0.05)，而SfruPBP3在雌雄触角中的表达水平无显著差异(P> 0.05，图5)。

图2 鳞翅目昆虫PBPs进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of lepidopteran PBPs注：4个SfruPBPs以方框标示。Four SfruPBP genes are boxed. 低于50的自举值未显示。Bootstrap values lower than 50 are not shown. 物种名与PBPs登录号 Species names and GenBank accession numbers of PBPs：草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda：SfruPBP1-SfruPBP4(MN541407-MN541410)；小地老虎Agrotis ipsilon：AipsPBP1-AipsPBP3(AFM36756-AFM36758)；柞蚕Antheraea pernyi：AperPBP1(X96773)，AperPBP2(X96860)，AperPBP3(AJ277265)；多音天蚕Antheraea polyphemus：ApolPBP1(X17559)，ApolPBP2(AJ277266)，ApolPBP3(AJ277267)；脐橙螟Amyelois transitella：AtraPBP1(ACX47890)，AtraPBP2(ACX47891)；家蚕Bombyx mori：BmorPBP1(NM_001044029)，BmorPBP2(XP_012545845)，BmorPBP3(NM_001083626)，BmorPBP4(Vogt et al., 2015)；二化螟Chilo suppressalis：CsupPBP1(GU321120)，CsupPBP2(EU825762)，CsupPBP3(HM190253)，CsupPBP4(Chang et al., 2015)；稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis：CmedPBP1(JN867060)，CmedPBP2(KC507181)，CmedPBP4(KC507185)，CmedPBP5(KP975161)；苹果褐卷蛾Epiphyas postvittana：EposPBP1(AF416587)，EposPBP2(AF411459)，EposPBP3(EV811597)；棉铃虫Helicoverpa armigera：HarmPBP1(HQ436362)，HarmPBP2(HQ436360)，HarmPBP3(AF527054)；烟夜蛾Helicoverpa assulta：HassPBP1(AY864775)，HassPBP2(EU316186)，HassPBP3(DQ286414)；烟芽夜蛾Heliothis virescens：HvirPBP1(X96861)，HvirPBP2(AM403491)；舞毒蛾Lymantria dispar：LdisPBP1(AF007867)，LdisPBP2(AF007868)；烟草天蛾Manduca sexta：MsexPBP1(AF117593)，MsexPBP2(AF117588)，MsexPBP3(AF117581)，MsexPBP4(Vogt et al., 2015)；欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis：OnubPBP1-OnubPBP5(GU826166-GU826170)；亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis：OfurPBP1-OfurPBP5(LC027678-LC027682)；小菜蛾Plutella xylostella：PxylPBP1(ACI28451)，PxylPBP2(AGH13203)，PxylPBP3(BAG71422)；蛀茎夜蛾Sesamia nonagrioides：SnonPBP1(AAS49922)，SnonPBP2(AAS49923)；大螟Sesamia inferens：SinfPBP1(AEQ30019)，SinfPBP2(AEX58642)，SinfPBP3(AEQ30020)；梨小食心虫Grapholita molesta：GmolPBP1(AVZ44710)，GmolPBP2(AHZ89398)，GmolPBP3(AHZ89399)；斜纹夜蛾Spodoptera litura：SlituPBP1-SlituPBP4(AIS72933-AIS72935; AXO77502)；茶尺蠖Ectropis obliqua：EoblPBP1(KT991348)，EoblPBP2(KX421383)；桃蛀螟Conogethes punctiferalis：CpunPBP1(MH006604)，CpunPBP2(KP985228)，CpunPBP3(KP985229)，CpunPBP5(KP985227)；云南松毛虫Dendrolimus houi：DhouPBP1(KC783384)；DhouPBP2(KF487588)；双委夜蛾Athetis dissimilis：AdisPBP1(KR780029)，AdisPBP2(KR780030)；甘蓝夜蛾MbraPBP1(AF051143)，MbraPBP2(AF051142)，MbraPBP4(AF461143)；粘虫Mythimna separata：MsepPBP1(MH168090)；MsepPBP2(MH168089)；海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis：SlittPBP1-SlittPBP4(Walker et al., 2019)。

图3 4个SfruPBPs基因在基因组上的分布(A)以及内含子结构(B)Fig.3 Genomic locations (A) and exon-intron structures (B) of four SfruPBP genes注：括号中的数字为内含子长度。Note：Numbers in parentheses indicate the size of introns.

图4 SfruPBPs基因在成虫不同组织中的表达模式Fig.4 Expression pattern of SfruPBPs in various adult tissues注：“头”表示去除触角的头部。Note：“Head” indicates heads without antennae.

图5 SfruPBPs基因在雌雄成虫触角中的相对表达水平Fig.5 Relative expression levels of SfruPBP genes in male and female antennae注：“*”表示差异显著，“ns”表示差异不显著(学生氏t测验，P<0.05)。Note：“*” indicates significant difference, “ns” stands for not statistically significant (Student’s t-test, P<0.05).

3 结论与讨论

PBPs与进入触角感器的性信息素分子的结合是昆虫性信息素通讯的第一步，因此PBPs对于昆虫的求偶、交配以及种群繁衍至关重要。若敲除PBPs基因或抑制其表达，昆虫对性信息素的嗅觉反应显著降低(Zhuetal., 2016; Yeetal., 2017; Yuetal., 2018; Dongetal., 2019)。草地贪夜蛾同样依赖种内性信息素完成求偶与交配，其性信息素包括Z9-14: OAc、Z11-16: OAc等多种组分，草地贪夜蛾对这些性信息素组分的识别应当也会需要PBPs的参与(江南纪和王琛柱, 2019)。本研究成功克隆了草地贪夜蛾4个SfruPBPs，并分析了它们的序列特征、基因组位置、外显子-内含子结构以及组织表达模式。本研究结果为后续探索这些基因在性信息素通讯中的功能，以及利用这些基因作为靶标开发绿色防控技术奠定了基础。

不同鳞翅目昆虫所具有的PBPs基因数量不同。PBPs基因数量较多的有欧洲玉米螟Ostrinianubilalis(5个)、亚洲玉米螟O.furnacalis(5个)、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocismedinalis(5个)、二化螟C.suppressalis(4个)、烟草天蛾Manducasexta(4个)等(Allen and Wanner, 2011; Changetal., 2015; Vogtetal., 2015; Liuetal., 2017)。夜蛾科昆虫一般表达3个PBPs，但本实验从草地贪夜蛾中克隆了4个SfruPBPs基因，这与斜纹夜蛾中鉴定的PBPs基因数量一致(孙佳斌等, 2018)。虽然SfruPBP4与其它3个SfruPBPs蛋白的一致性均较低，且SfruPBP4蛋白序列的长度也显著大于另外3个SfruPBPs，但仍然推测SfruPBP4属于PBP家族，证据主要有(1)SfruPBP4的蛋白序列具有鳞翅目PBP的典型特征，即氨基端分泌信号肽和位置保守的6个半胱氨酸残基；(2)在进化树中SfruPBP4显示出与其它鳞翅目昆虫PBPs紧密的亲缘关系；(3)SfruPBP4基因与SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3在草地贪夜蛾基因组上呈串联排列，并且均具有保守的内含子插入位点。在家蚕、烟草天蛾、欧洲玉米螟和亚洲玉米螟基因组中，PBPs基因也均为串联排列(Gongetal., 2009; Vogtetal., 2015; Yasukochietal., 2018)。草地贪夜蛾基因组中存在4个SfruPBPs很可能是源自进化中的基因加倍事件。

研究PBPs基因在不同组织中的表达模式有助于推测基因的功能。一般认为，在雄蛾触角中表达量高而在雌蛾触角中表达量低的PBPs基因可能会参与识别雌蛾释放的性信息素(王菁桢等, 2017; 汪超等, 2019)。本研究发现SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3均大量表达于触角，且SfruPBP1和SfruPBP2在雄蛾触角中的表达量显著高于雌蛾，暗示着它们可能参与性信息素的识别。SfruPBP3在雌雄蛾触角中的表达量差异不显著，推测其可能在识别植物挥发物中起作用。在其它昆虫中，PBPs基因也是多表达于成虫触角，并能够结合性信息素和植物挥发物等(Yuetal., 2018; Sunetal., 2019)。本研究还发现草地贪夜蛾SfruPBP4仅在雄蛾腹部表达。在其它鳞翅目昆虫中，也发现一些PBPs表达于非嗅觉组织，例如烟草天蛾MsexPBP4仅表达于成虫马氏管(Vogtetal., 2015)，斜纹夜蛾SlituPBP4仅表达于雄成虫生殖系统(孙佳斌等, 2018)。此外，针对SlituPBP4重组蛋白的荧光竞争结合实验结果表明，该蛋白对多种性信息素和植物挥发物均没有结合能力，推测该蛋白可能在嗅觉以外的生理过程中起作用(孙佳斌等, 2018)。本研究未对草地贪夜蛾SfruPBP4开展功能实验，因此该基因在生理过程中的作用尚不明确。在下一步研究中，将综合利用蛋白异源表达、荧光竞争结合和RNA干扰等技术，阐明SfruPBP4的生理功能。