王倩颖, 崔树勋

(西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室, 成都 610031)

长期以来, 科学家们一直在研究贻贝的湿黏附性能, 发现多巴(3,4-二羟基苯丙氨酸, DOPA)和富含赖氨酸的蛋白质是产生这种黏附力的主要原因[1～3]. 多巴胺[4-(2-乙胺基)苯-1,2-二酚, DA]因分子内部含有邻苯二酚官能团, 具有与DOPA相似的分子结构[4～7]. DA在溶液中会自发聚合/组装形成聚多巴胺(PDA)[8,9]. 近年来, PDA作为一种新型表面涂层备受关注[10]. PDA具有与贻贝足丝蛋白类似的黏附性能, 易沉积在几乎所有类型的无机和有机基质上, 具有持久的耐用性. PDA可通过溶解氧化法[11]、 酶促反应法[12]及电极沉积法[13]等简便的聚合方法获得, 并在生物材料[14～17]、 电化学器械[18,19]、 光催化[20]和表面功能化[21～26]等领域有潜在的应用价值.

尽管关于PDA应用的报道很多, 但PDA自身的形成过程和聚合机理迄今仍无定论. Yao等[27]认为DA聚合机理是“氧化-聚合”机理, 即DA首先被氧化生成多巴胺醌, 再通过迈克尔加成发生分子内环化, 经氧化重排生成5,6-二羟基吲哚(DHI), DHI与吲哚琨发生支化反应生成同分异构体, 再经反歧化等反应生成PDA复合层[28]. Bielawski等[29]认为是非共价键作用使之聚合, 这些非共价键使PDA高度稳定且不溶于水. 该模型认为, 一方面, 2个DA分子和1个DHI分子通过非共价键作用(如氢键等)形成三聚体; 另一方面, DHI自聚形成三聚体, 两种三聚体共同作用形成PDA, 即共价键和非共价键作用均发生并在PDA形成过程中起到不同作用. Lee等[30]通过高效液相色谱(HPLC)-质谱分析也证明了PDA的形成是非共价自组装和共价聚合相结合的结果. Della等[31]根据黑色素模型认为DA聚合沉积过程中可能经历3条反应途径, 并强调最后形成的PDA结构取决于聚合反应初期. 由于DA中存在的活性位点较多, Cui等[32,33]通过活性位点较少的DA衍生物2-(4-甲氧基-3-甲苯基)乙胺(MOE)作为模型进行研究, 结果表明DA聚合反应中应存在自由基聚合路径. 本文以二甲基亚砜(DMSO)与依达拉奉(Edaravone)为自由基抑制剂, 通过紫外-可见光谱等研究了DA聚合中可能存在的自由基聚合路径, 并考察了pH值对DA聚合速率的影响.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

多巴胺(CAS登录号62-31-7)购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司; 三羟甲基氨基甲烷(Tris, CAS登录号77-86-1)、 二甲基亚砜及盐酸均购于成都恒润达川科技有限公司; 依达拉奉(CAS登录号89-25-8)购于上海泰坦科技股份有限公司; 实验用水均为去离子水(电阻率>18 MΩ·cm).

UV-Vis Lamda 35型紫外-可见(UV-Vis)光谱仪, 美国Perkin-Elmer公司; STARTER 3100型pH计, 美国奥豪斯公司.

1.2 实验过程

配制pH值为7.5, 8.5和9.5的Tris-HCl缓冲溶液; 分别取3份pH值为8.5和9.5的Tris-HCl缓冲溶液放入不同烧杯中, 加入不同量的DMSO, 磁力搅拌10 min, 制得DMSO体积分数分别为20%, 10%[34]和0的[32]溶液; 在溶液中分别加入DA, 使溶液中DA浓度均为1 mg/mL. 反应开始后, 每隔10 min取3 mL反应溶液置于石英比色皿中, 检测反应液的紫外-可见光谱[35]; 另取10 mL pH=8.5的缓冲溶液加入烧杯中, 随后同时加入Edaravone与DA[其中DA含量仍为1 mg/mL,n(DA)∶n(Edaravone)=1∶1], 在反应过程中保持磁力搅拌, 并用紫外-可见光谱跟踪反应; 分别将10 mL pH值为7.5, 8.5和9.5的缓冲溶液加入不同烧杯中, 加入DA使其浓度均为1 mg/mL, 通过分析溶液的颜色变化及紫外吸光度研究不同pH条件下的聚合反应. 所有反应均在室温(约24 ℃)下进行.

2 结果与讨论

2.1 验证多巴胺聚合存在自由基聚合路径

在DA聚合过程中加入自由基清除剂DMSO[36,37], 以降低系统中自由基的浓度. 图1(A)～(F)给出pH=9.5时不同DMSO浓度下DA反应液的颜色随时间的变化. 未添加自由基清除剂的溶液在90 min内完全变成黑色; DMSO体积分数为10%的反应溶液在140 min后完全变成黑色; DMSO体积分数为20%的反应溶液在180 min后才完全变黑. 这些结果表明DMSO可抑制DA的聚合过程. 图2(A)给出了在pH=9.5时, 含不同体积分数DMSO的DA反应溶液在405 nm处的吸光度随时间的变化. 由图2(A)可见, 80 min后, 未添加DMSO的DA溶液吸光度从0增大到3.0, 吸光度增大速率为0.041 min-1; 同样时间内, DMSO体积分数为10%的反应溶液的吸光度从0增大到2.2(图S1, 见本文支持信息), 吸光度增大速率为0.029 min-1; DMSO体积分数为20%的反应溶液的吸光度从0增大到1.7, 吸光度增大速率为0.022 min-1. 当溶液中含有DMSO时, DA的聚合速率显著降低, 而且聚合速率随着DMSO浓度的增大而降低, 表明DMSO可抑制DA的聚合过程.

Fig.1 Color change of dopamine solutions under pH of 9.5(A—F) and 8.5(G—L) with time of 10 min(A, G), 40 min(B, H), 90 min(C, I), 120 min(D, J), 150 min(E, K) and 180 min(F, L) Volume fraction of DMSO(%): a. 20; b. 10; c. 0.

改变pH条件, 在pH=8.5时观察到的现象与pH为9.5时的现象相似[图1(G～L), 图2(B), 图S2, 见本文支持信息]. 这些结果表明pH值为8.5和9.5时, DA聚合过程均存在自由基聚合路径.

通过延长反应时间发现, 虽然DMSO会减缓DA聚合反应, 但并不能完全抑制其聚合, 且抑制效果随着时间延长而逐渐减弱. 由图1可见, 溶液的颜色在反应时间足够长之后均完全变黑. DA的聚合机理非常复杂, 受到很多因素的影响. 此前已有多个研究组利用不同的氧化剂[过硫酸铵(APS)和高碘酸钠(Na5IO6)等]研究了DA的聚合过程, 结果表明其中存在氧化聚合路径[11,23], 因此我们推测在DA聚合过程中自由基聚合与氧化聚合等其它聚合方式可能同时存在, 即聚合反应中至少存在两条路径. 实验中DMSO可抑制自由基聚合, 但其它的聚合路径仍在进行, 并最终使DA聚合完全, 因此反应后期溶液的吸光度基本一致. 这也可能是DA的结构到目前仍不能确定的原因. 对比图2(A)和(B)可知, 在DMSO浓度相同时, 较高的pH值下聚合反应速率会更快.

Fig.2 Absorbance at 405 nm of a dopamine reaction solution containing different amount ofDMSO as a function of time under pH of 9.5(A) and 8.5(B) Volume fraction of DMSO(%): a. 0; b. 10; c. 20.

为了进一步证明抑制自由基可以抑制DA聚合, 采用另一种自由基抑制剂Edaravone[38]研究了DA的聚合. 实验结果表明, 添加Edaravone的反应液很难完全变黑, 而未添加Edaravone的反应液通常在180 min内完全变黑(图3).

Fig.3 Color change of dopamine solutions with(a) and without(b) edaravone with time of 10 min(A), 40 min(B), 90 min(C), 120 min(D), 150 min(E) and 180 min(F)

405 nm处的吸光度变化结果(图4)表明, 110 min后, 未添加Edaravone的DA溶液的吸光度从0增大到1.5083, 吸光度增大速率为0.0137 min-1, 远远高于添加Edaravone反应溶液的吸光度(从0增大到0.1121)和吸光度增大速率(0.001 min-1), 表明Edaravone可显著抑制DA的聚合过程.

Fig.4 Absorbance at 405 nm of a dopamine reaction solution without edaravone(a) and with edaravone[n(DA)∶n(edaravone)=1∶1](b) as a function of timeThe concentration of DA is 1 mg/mL and pH is 8.5.

上述实验结果表明, Edaravone对DA聚合有很好的抑制作用, 抑制效果比DMSO更显著. 这可能是因为, Edaravone具有比DMSO更好的自由基抑制效果, 并且Edaravone除了可以抑制自由基聚合, 还可抑制氧化聚合. Yamawaki等[39]报道, Edaravone可抑制细胞的氧化损伤和脂质过氧化. DA的聚合过程中可能同时存在自由基聚合与氧化聚合等多种路径. 而Edaravone可以抑制自由基聚合与氧化聚合两种途径, 故其抑制作用更显著.

2.2 pH值对多巴胺聚合的影响

图5给出不同pH值的缓冲溶液中, DA反应溶液在405 nm处的吸光度随时间的变化. 通过对比发现, 经过80 min后, pH=9.5的DA溶液的吸光度从0增大到3.0, 吸光度增大速率为0.041 min-1, 该速率高于pH=8.5时的速率(0.016 min-1, 吸光度从0增大到1.1), 更远远高于DA在pH=7.5时的速率(0.0025 min-1, 吸光度从0增大到0.2). 在pH=9.5的反应环境下, 溶液颜色完全变黑仅需要90 min, 而在pH=8.5和7.5的反应环境下则分别需要180 min和30 h. 随着pH值的增大, 溶液完全变黑(即反应完全)所需时间越来越短, 表明DA在pH值较高的条件下反应更快. 通常, 还原剂在碱性条件下氧化还原电位会更低, 从而更容易被氧化[40]. 上述结果验证了DA聚合反应中存在氧化聚合路径. 图6(A～F)给出不同pH值的DA溶液颜色随时间的变化. 可见, 反应液的颜色最终无法区分, 说明pH值只影响DA聚合的反应速度, 而并不影响反应液的最终状态(吸光度).

Fig.5 Absorbance at 405 nm of dopamine reaction solutions as a function of time under pH values of 9.5(a), 8.5(b) and 7.5(c)

Fig.6 Color change of dopamine reaction solution under pH values of 7.5(a), 8.5(b) and9.5(c) with time of 10 min(A), 80 min(B), 110 min(C), 140 min(D), 19 h(E) and 36 h(F)

研究发现, 当pH=7.5时, 在DA聚合反应前期, 吸收峰在480 nm; 随着反应进行, 吸收峰的位置向短波长方向逐渐移动, 最后固定在405 nm[图7(A)]. 推测反应初期可能先生成一种中间物, 中间物随后可发生聚合等反应, 最终形成PDA. 随着反应时间的延长, 反应后期在385 nm处出现了新的特征峰[图7(B)], 据此可推测在DA聚合过程中有可能生成一种新的物质.

Fig.7 UV-Vis absorption spectrum of dopamine reaction solution under pH value of 7.5with different time (A) 10—100 min; (B) 120—360 min.

3 结 论

通过在DA反应液中引入自由基抑制剂DMSO与Edaravone研究了其聚合反应. 结果表明, DMSO与Edaravone均可抑制DA聚合反应. 随着反应液中DMSO浓度的增大, 其抑制作用越来越显著, 可证实DA聚合中存在自由基聚合路径. DMSO虽然可以降低DA的聚合速率, 但并不能完全抑制其聚合, 说明DA除了自由基聚合外还存在其它反应路径. Edaravone具有比DMSO更显著的抑制效果, 可能因为Edaravone不仅是自由基抑制剂, 而且还可以抑制氧化反应. 我们推测DA的聚合过程中可能同时存在自由基聚合与氧化聚合等多种路径. 溶液pH值越高, DA聚合的速度越快, 但经过足够长时间后反应液的外观基本一致, 表明pH值会影响DA聚合反应的速度, 也可验证DA聚合反应中存在氧化聚合路径.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20190696.