陈晓凤，刘 刚，2*，李学理，汪淑芳，2，张晓喻，2，赵甲元

（1.四川师范大学生命科学学院，四川成都610101； 2.四川师范大学食品功能及加工应用研究所，四川成都610101）

我国桂花种植面积大[1]，桂花果实没有得到合理的利用，导致资源浪费.桂花种子相关的产品有一定的经济价值，充分、合理地开发利用桂花种子，是一种既节约资源又发展经济的环保研究项目.本实验以桂花种子油为材料，对其成分含量及抗氧化性进行研究.

1 材料、试剂与方法

1.1 材料本实验材料银桂Osmanthus fragrans[2]生长在四川师范大学成龙校区.经过与文献[3]中桂花的描述比较，确认这些植物的特征符合文献描述.该桂花9月开花，经过6～7个月的生长，果实由小变大，颜色由青变为青紫，到来年4月再变为紫黑、成熟的果实.采集该植物的果实，脱除果皮可得到种子，见图1.

1.2 试剂和仪器试剂：石油醚（成都市科隆化工试剂厂）、乙醇（成都市科隆化工试剂厂）、乙酸乙酯（成都市科隆化工试剂厂）、过硫酸钠（成都市科隆化工试剂厂）、ABTS（成都市科隆化工试剂厂）、DPPH（日本东京化成工业株式会社）、维生素E（vitamin E，VE）（国药集团化学试剂有限公司）、脂肪酸标准品（Omega公司）.

图1 桂花的果实、种子Fig.1 Fruit and seeds of O.fragrans

仪器：ESJ220-48型烘箱（上海-恒科技有限公司）、800Y型粉碎机（永康伯欧五金制造有限公司）、RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、WSL-2型比较测色仪（上海昕瑞仪器仪表有限公司）、HKC-40A型超声波仪器（昆山市超声仪器有限公司）、BioMate 3S型紫外分光光度计（Thermo公司）、GC-7890A型气相色谱仪（安捷伦科技有限公司）、JA5003型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）.

1.3 桂花种子油的提取方法将新鲜采摘的桂花果实进行人工去皮，用清水洗净外面粘附的果肉，得到白色的桂花种子，再将种子置于50℃烘干，用密封口袋包装，置于阴凉干燥处保存.采用超声波辅助提取法[4]，分别以石油醚、乙醇[5-6]为溶剂提取桂花种子油（OFSO）.桂花种子油的收得率[7]为：

1.3.1 石油醚提取法 按文献[8]的方法进行提取，称取40 g桂花种子，粉碎过80目，置于锥形瓶中，按固液比1∶5的比例将石油醚加入锥形瓶，封口膜封好，置于阴凉干燥处静置浸提12 h，再超声30 min.将锥形瓶中的上清液倒入圆底烧瓶，用旋转蒸发仪回收石油醚溶剂.得到桂花果种子油有少量溶剂的残留，可将提取的油置于培养皿，挥发30 min，得到桂花种子油.二次提取的油混合，然后6 000 r/min离心4 min，得到澄清的种子油.

1.3.2 体积分数95%乙醇提取法 按文献[8-9]的方法，称取40 g桂花种子粉末，过80目筛，置于锥形瓶.按固液比1∶5加入质量分数95%的乙醇，封口膜封好，至于阴凉干燥处，浸提12 h，超声30 min.将上清液倒出，离心，上清液转移至圆底烧瓶，旋转蒸发去除乙醇，得到桂花种子油.二次浸提的油混合，6 000 r/min离心4 min，除去杂质，得到种子油.

1.4 抗氧化活性和成分的测定方法

1.4.1 样品液的配置 样品溶度配置：取5只试管，在第一支试管中加1 g种子油，再加入1 mL乙酸乙酯混匀得到质量浓度500.000 g/mL的种子油，依次对等稀释得到质量浓度为 250.000、125.000、62.500、31.250 mg/mL 的种子油用于实验.用 ABTS 法[10-11]和 DPPH 法[12-14]测定桂花种子油抗氧化活性.

1.4.2 桂花种子油抗氧化活性的测定（ABTS法）ABTS溶液配置：用天平称取0.384 g的ABTS定容到10 mL，得到浓度7 mmol/L的溶液，称取0.013 4 g的过硫酸钾，定容至10 mL，得到浓度4.9 mmol/L的溶液，然后将这2种溶液等量混合，置于暗处避光保存12 h，再用无水乙醇将混合溶液稀释至在734 nm处，测得吸光度值为0.7±0.02.分别设置3种测定液：

空白组：0.2 mL乙酸乙酯+3.8 mL ABTS；

实验组：0.2 mL样品+3.8 mL ABTS；

阳性组：0.2 mL VE稀释液+3.8 mL ABTS.

用0.2 mL乙酸乙酯+3.8 mL乙醇的溶液调整仪器零点后，分别将4种质量浓度的样品和4种质量浓度的阳性对照进行测定.按上述实验准备空白对照、实验组和阳性对照液测定液，测定液放置6 min后，在734 nm处测定吸光度值，吸光度值用A表示.做3次平行测定，依据公式计算清除率[8]为：

1.4.3 桂花种子油抗氧化活性的测定（DPPH法）DPPH溶液的配置：先称取7.8 mg左右的DPPH于100 mL的质量分数95%的乙醇溶液定容，避光保存.再分别设置3种测定液：

空白组：0.2 mL乙酸乙酯+3.8 mL DPPH；

实验组：0.2 mL样品+3.8 mL DPPH；

阳性组：0.2 mL VE稀释液+3.8 mL ABTS.

用0.2 mL乙酸乙酯+3.8 mL质量分数95%乙醇溶液调整仪器零点后，分别将4种质量浓度的样品和4种质量浓度的阳性对照进行测定.按上述实验准备空白对照、实验组和阳性组测定液，且都避光放置保存2 h，在517 nm处测定吸光度值，吸光度值用A表示.3次平行测定，依据（1）式计算清除率[8].

1.4.4 桂花果油成分的测定方法 气相色谱法是色谱法的一个重要分支，它的主要特点是灵敏度高，重现性好，准确度高，操作简便、快速、高效[16-18]，所以本实验选取这种方法测定桂花种子油的成分与其在油中的占比.

依据GB5009.168——2016的方法，具体测定的条件为：HP-FFAP色谱柱、环境温度20℃、大气湿度39.4%、FID检测器、载气流量2 mL/min、空气流量 400 mL/min、氢气流量 40 mL/min、柱温60～200℃、进样口温度220℃、检测器温度300℃.

1.5 统计分析 用SPSS20软件进行统计分析，回归分析采用简单回归法.清除质量分数50%抗氧化剂为半数抑制质量分数（IC50）[15]，该数值越大，抗氧化活性越低.根据抗氧化剂的质量分数-清除率的关系，应用Probit回归法求出.

2 结果与分析

2.1 种子油收得率的比较经2种方法提取桂花种子，油的收得率根据1.3计算，得到石油醚提取的收得率为15.300%，乙醇提取的收得率为11.600%.因此，本实验采用石油醚提取桂花油的方法.

2.2 种子油的感官描述和色度值经石油醚提取法和高质量分数乙醇提取法，得到桂花种子油，离心后对其进行感官分析描述、色度仪分析测定色度值.结果为石油醚提取的植物油呈黄色，质量分数95%乙醇提取的植物油呈亮黄橙色.

比较2种提取方法，石油醚对油的溶解度好，提出来的油清亮，而质量分数95%乙醇提取出来的油比较浑浊.因此浸提后的液体要先进行一次离心，最后提出的油才会比较清亮，如果最后有少量的溶剂残余，可在阴凉干燥处放置晾干.

由于石油醚提取法具有更大的优势，本实验最终采用石油醚作为提取溶剂.

2.3 桂花种子油的抗氧化活性—ABTS法根据1.4.2的方法，测定VE和桂花种子油对ABTS清除率，进一步回归分析，结果见图2、3.

图2 VE对ABTS自由基的清除效果Fig.2 VE’s scavenging capacity against ABTS

由分析得到线性回归方程，VE的清除率方程为

用Probit法求出半数抑制质量浓度为0.250 mg/mL.桂花种子油的清除率方程为

进而计算出桂花果油对ABTS的半数抑制质量浓度为271.963 mg/mL.由此看出桂花种子油相比于VE的抗氧化性较弱，但仍具有一定的抗氧化活性.

图3 OFSO对ABTS自由基的清除效果Fig.3 OFSO’s scavenging capacity against ABTS

2.4 桂花种子油的抗氧化活性（DPPH法）根据1.4.3的方法，测定VE与桂花种子油对DPPH法自由基清除效果，进一步回归分析，结果见图4、5.

图4 VE对DPPH自由基清除效果Fig.4 VE’s scavenging capacity against DPPH

图5 OFSO油对DPPH自由基清除效果Fig.5 OFSO’s scavenging capacity against DPPH

由统计分析得到质量浓度-抑制率线性回归方程，VE的清除率方程为

用Probit法算出半数抑制质量浓度为0.257 mg/mL.桂花种子油的抑制方程为

进而计算出桂花果油对DPPH的半数抑制质量浓度为286.347 mg/mL.由此看出桂花种子油相比于VE的抗氧化性较弱，但仍具有一定的抗氧化活性.

综上所述，在质量浓度为62.500～500.000 mg/mL，ABTS自由基的清除率为 38.460% ～89.840%，半数抑制质量浓度为271.963 mg/mL，DPPH的自由基清除率为42.370% ～87.390%，半数抑制质量浓度为286.347 mg/mL.桂花种子油对DPPH自由基的清除和ABTS自由基的清除都有较为相似的结果.因此，证明桂花种子油具有抗氧化活性.

抗氧化剂用途广泛，可用于功能食品的开发，减缓油脂等食物的氧化，延长产品的贮存期.天然抗氧化剂具有安全、营养的功能，而一些合成的抗氧化剂，如BHA、BHTD等，对人体是具有一些毒副作用.由于人们对健康更高的追求，推动了天然抗氧化剂代替合成抗氧化剂的研究.我国桂花资源丰富，但是，其果实却未被充分的利用，本实验对桂花种子抗氧化性的研究，有助于资源开发和利用，同时对天然抗氧化剂做出一定的贡献，为进一步的研究提供一些参考.

2.5 桂花种子油的成分测定按1.4.4的方法，用气相色谱法[19]测定桂花种子油的成分.混合标准脂肪酸的GC谱图见图6，测定样品的GC谱图见图7，主要成分和主要成分在油中所占比例，见表1.

桂花种子油的8种主要成分中，油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸总占比为96.000%，不饱和脂肪酸中的单不饱和脂肪酸中，油酸所占比42.600%、花生一烯酸占0.240%，多不饱和脂肪酸中亚油酸占40.900%、亚麻酸占0.950%，在种子油中不饱和脂肪酸的总占比84.700%，而饱和脂肪酸较少，如棕榈酸占比11.200%、硬脂酸占比3.030%、剩下的不饱和脂肪酸占比0.410%.因此，桂花种子油是高亚油酸型的植物油.

图6 脂肪酸标准品的GC图谱Fig.6 GC atlas of standard fatty acids

图7 桂花种子油的GC图谱Fig.7 GC atlas of OFSO

表1 桂花种子油的主要成分和其所占比例（n=3）Tab.1 The main components and content of OFSO （n=3）

通过气相色谱法对桂花种子油进行成分与含量分析，桂花种子油中的主要成分是不饱和脂肪酸，其中单不饱和脂肪酸[20]（油酸、花生一烯酸）与多不饱和脂肪酸[21]（亚油酸、亚麻酸）都有各自的作用，而饱和脂肪酸含量很少.总的来说不饱和脂肪酸是人体的必需脂肪酸，具有降低血脂、血压、软化血管及促进微循环的作用，可预防或是减少心脑血管疾病的发生[22-23].因此，桂花种子油在食品和功能性食品中都有一定的应用和开发前景.

3 结论

我国桂花资源丰富，本实验对桂花种子油进行了抗氧化研究和成分测定，既避免了资源的浪费和环境的污染，也充分发挥了植物副产物的价值.

1）采用DPPH法与ABTS法测定桂花种子油的抗氧化活性，在质量浓度为62.500～500.000 mg/mL之间，ABTS自由基的清除率在38.460% ～89.840%，半数抑制质量浓度为271.963 mg/mL，DPPH的自由基清除率为42.370% ～87.390%，半数抑制质量浓度为286.347 mg/mL.因此，实验证明桂花种子有较强的抗氧化活性，而抗氧化剂有清除体内的自由基的作用，有望用于延缓衰老和美容和功能性食品的开发等方面.

2）采用气相色谱法测定桂花种子油，数据表明其中主要含不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸，是高亚油酸型的植物油.桂花种子油中的不饱和脂肪酸具有软化血管、降低血压的作用，期望今后能在开发用于预防心脑血管疾病的新资源植物.