高若男，陈亚楠，黄涛*，唐中林

(1 石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000;2 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein-7，BMP7)，又称为骨发生蛋白-1，由剑桥大学Celeste 等在1990年筛选出来[1]。BMP7是一种酸性多肽且为骨形态发生蛋白家族(BMPs) 中的一员，属于转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β) 超家族，能够诱导血管周围及结缔组织中未分化的间充质细胞向骨和软骨细胞方向分化，从而形成骨组织，是多种细胞与组织的多功能调节因子[2-3]。

BMP7具有多种功能，与许多系统的发育及形成密切相关，在肾脏、心脏、脂肪、卵巢等组织都可检测到其表达，并对这些组织的发育具有调节作用，同时能够诱导脂肪干细胞的分化、改善代谢，在某些肿瘤和癌细胞中也有一定的表达[4]。在小鼠中敲除BMP7基因第6、7外显子导致小鼠骨骼发育不全，肾脏的发育受影响，BMP7基因对动物的生长性状必定存在着一定的关联作用[5]。BMP7在脂肪形成和能量消耗中起重要作用，在哺乳动物棕色脂肪组织分化中发挥重要功能，而白色脂肪细胞在特定的情况下可以获得棕色脂肪细胞的特征[6]，所以BMP7基因对白色脂肪组织的发育也具有一定的调控作用[7-8]。黄牛BMP7基因中的4个基因座对黄牛生长性状具有调控作用，显著影响黄牛的体重、体长和胸围[9]。肉鸡BMP7基因编码区第567 bp 处的1个C→T的变异位点对大胸肌重有显著影响[10]。BMP7基因还与大黄鱼的体型显著相关，能够调控大黄鱼种群生长和体型[11]。在猪中BMP7基因 3′-UTR中的1569 A>G多态性与大白猪窝重性状显著相关，AA和AG是影响仔猪总产仔数和产活仔数的有利基因型[12]。

BMP7基因对动物生长性状有显著影响，对猪的繁殖性状也有影响，但其对猪生长性状的作用研究很少。本研究将筛查BMP7基因多态位点并分析其猪生长性状的影响，为猪生长发育的分子标记辅助选择提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

采集来自河北某种猪场体重相近的大白母猪296头，用耳号钳夹取约1 cm大小耳组织样，放入含有75%酒精的EP管中，带回实验室，用于BMP7基因SNP分型。

1.1.2 主要试剂及仪器

TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2购自Takara公司，RNA酶、蛋白酶K、1 kb Marker购自全式金公司，血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒购自TIANGEN公司。琼脂糖购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

将耳组织样用蒸馏水清洗后剪碎，用DNA试剂盒法提取猪耳组织基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，Nanodrop2000核酸蛋白分析仪检测浓度，放于-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计(表1)

表1 BMP-7 PCR扩增引物

根据NCBI SNP数据库中猪BMP7基因多态信息，选择了5个可能的多态位点，根据NCBI中的DNA序列，使用Primer Premier5.0软件设计引物，并由北京天一辉远公司合成(表1)。

1.2.3 PCR扩增及测序鉴定

将30个个体的DNA样本等量混合作为模板，以表1中的引物进行PCR扩增。反应体系：2×Premix Taq 25 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 1.5 μL，去离子水22.5 μL，总体系为50 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸2 min，34个循环；4 ℃保存。将PCR产物送至北京天一辉远生物科技有限公司进行双向测序。

1.2.4 基因分型

委托康普森公司对实验群体的296个样本SNP相关信息进行飞行时间质谱(sequenom)检测。

1.2.5 数据处理

整理BMP7基因SNP分型结果，统计基因频率、基因型频率，用SPSS19.0软件将基因型与生长性状进行关联性分析。使用最小二乘法模型：Yijk=u+Bi+Sj+Gk+eijk，Y为个体生长性状观测值；u为所选群体的生长性状均值；Bi为第i个个体的基因型效应；Sj为性别j的效应；Gk为基因k的效应；eijk为随机残差效应。此模型用来分析单个SNP位点的基因型效应对某一生长性状的影响。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

采用退火温度梯度PCR，以确定各对引物的退火温度。对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，产物长度分别为285、297、301、306、347 bp，大小与预期一致，特异性良好，可送公司测序，进行SNP位点的初步检测。

2.2 BMP7基因SNP位点的筛选结果

将上述混合DNA样PCR产物进行测序分析，在rs5696023834，rs337405652多态，检测到的A83509G(图1)和G84966 A(图2)，均属于单核苷酸变异(表2)，为碱基替换；且均为错义突变。其他3个位点均未检测到多态。

图1 BMP7基因不同引物PCR扩增结果

图2-1 多态位点A83509G

图2-2 多态位点G84966A

表2 SNP位点信息

2.3 群体遗传学分析

对两个多态位点在所选群体中进行飞行时间-质谱法检测结果统计分析(表3)显示，在群体中，A83509G多态位点均检测到AA、AG、GG3种基因型，G84966 A多态位点均检测到AA、GA、GG3种基因型，A83509G位点、G84966 A位点G均为优势等位基因。在群体中，A83509G位点、G84966 A等位基因G的基因频率均较高，分别为0.80、0.62。在群体中，A83509G位点的多态信息含量为0.265，G84966 A位点的多态信息含量为0.274，两个位点均处于0.25

2.4 BMP7基因型对生长性状的影响

采用最小二乘均值差异显著性检验对两个多态位点与猪的生长性状进行关联性分析，两个位点AA型生长速度最快、GG型眼肌面积均为最大(表4)。

表4 BMP7基因多态性对生长性状的影响

注：同一个位点同列肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.5 BMP7单倍型对猪生长性状的影响(表5)

表5 BMP7基因A83509G 和G84966 A位点单倍型对大白猪生长性状的影响

注：同一个位点同列肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

在本研究中共检测到A83509G位点和G84966 A位点单倍型7种，其中AGGA型校正达100 kg日龄和校正达100 kg眼肌面积优势最大(P<0.05)(表5)。

3 讨论

生长性状作为猪育种中的重要经济性状之一。BMP7对生长性状有重要作用，通过研究BMP7基因多态性，有望发现新的分子标记，对提高猪生长性能具有重要的意义。

NCBI中的SNP数据库汇集了大量的潜在SNP信息，是开发分子标记的重要依据。本研究通过SNP数据库提供的信息确定了2个错义突变位点，说明该数据库信息具有一定的可信性；但其它3个均未检测到多态，这有可能是数据库的数据质量问题，或者是存在群体差异。

研究发现，通过促进Pax-3的表达及细胞间增殖信号的相互作用，能够延长肌肉的分化过程，使BMP7保持在刺激生肌细胞生长的浓度，从而促进了肌肉组织的发育[13]。秦楠等[14]证实猪BMP7基因能增加表达Pax-3前体肌细胞的数量而促进肌肉的生长。Zhou G等[15]通过研究猪肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞的基因表达谱的差异，发现BMP7主要在肌内脂肪细胞中表达，且在猪肌内脂肪细胞中具有高表达，揭示了BMP7基因能够参与肌内脂肪细胞的分化。在牛和肉鸡中，BMP7多态对生长性能有显著影响[9-10]。本研究中，BMP7基因A83509G位点校正达100 kg体重日龄/day AG、GG基因型显著高于AA基因型(P<0.05)，校正达100 kg眼肌面积(cm2)GG基因型显著高于AG基因型(P<0.05)；G84966 A位点校正达100 kg体重日龄/day GG基因型显著高于AA基因型(P<0.05)；校正达100 kg眼肌面积(cm2)GG基因型显著高于AA基因型(P<0.05)，这与王鑫磊等[9]、程博涵等[10]的BMP7基因突变位点有所差异，原因可能是不同物种间遗传结构差异。

本试验通过对BMP7基因多态性的研究，为其功能研究奠定了良好的理论基础。该研究表明BMP7基因与大白猪肌肉、脂肪生长性状具有一定的显著关联性，可根据育种目标选择生长速度快，眼肌面积大的个体作为选育对象。

本研究证实了BMP7基因上存在两个多态位点：A83509G位点和G84966A，且两个位点多态性对猪校正达100 kg日龄、校正达100 kg眼肌面积具有显著影响，有望作为猪生长性状选育的分子标记。