石玥 刘雁峰 穆国华 王铁枫 姜晶 何波琳 乔婷 王佳楣

摘要 目的：探索骨碎补及其主要成分对胚泡着床障碍模型小鼠子宫内膜的影响。方法：实验动物分为7组：空白组、模型组、西药组I（补佳乐组）、西药组II（阿司匹林组）、骨碎补组、骨碎补总黄酮组、骨碎补柚皮苷组，以GnRHa+HMG+HCG方法造模，干预后检测各组相关指标的表达量。结果：骨碎补组及总黄酮组小鼠子宫内膜同源盒基因10（HOXA-10）mRNA表达明显增加（P<0.05）;骨碎补组、总黄酮组及柚皮苷组白血病抑制因子（LIF）表达明显增加（P<0.05）;骨碎补组整合素ανβ3表达明显增加（P<0.05），总黄酮组差异无统计学意义（P>0.05），但积分光密度值明显增加（P<0.05）。结论：骨碎补可能通过调节胚泡着床期子宫内膜HOXA 10、LIF、整合素ανβ3的表达，有利于胚泡对子宫内膜的黏附，从而改善子宫内膜容受性。总黄酮作为骨碎补药材的主要活性成分，亦可改善子宫内膜容受性。

关键词 骨碎补;总黄酮;柚皮苷;子宫内膜容受性;同源盒基因A10;白血病抑制因子;整合素ανβ3

Effect of Rhizoma Drynariae and Its Main Component on HOXA-10 mRNA，LIF and Integrin ανβ3 Expression in Mice Endometrium

SHI Yue1，LIU Yanfeng2，MU Guohua2，WANG Tiefeng2，JIANG Jing1，HE Bolin1，QIAO Ting1，WANG Jiamei1

（1 Haidian Maternal & Child Health Hospital，Beijing 100080，China; 2 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100010，China）

Abstract Objective：To observe effects of rhizoma drynariae and its main components on endometrium of mice with blastocyst implantation disorder.Methods：Divide the experimental animals into 7 groups：a blank group，a model group，a western medicine treated group 1 （progynova group），a western medicine treated group 2 （aspirin group），a rhizoma drynariae group，an osteopractic total flavone group and a rhizoma drynariae naringin group.Mice model with GnRHa+HMG+HCG was established.We administrated drugs and tested the expression amount of each index in mice endometrium.Results：Expression of HOXA-10 mRNA in mice endometrium of rhizoma drynariae group and total flavone group increased significantly （P<0.05）.Rhizoma drynariae group，total flavone group and naringin group had increased LIF expression in mice endometrium （P<0.05）.Rhizoma drynariae group had an increased integrin ανβ3 expression in mice endometrium （P<0.05），there was no significant difference in total flavone group （P>0.05），but the integral optical density was significantly increased （P<0.05）.Conclusion：Rhizoma drynariae may regulate the expression of HOXA-10，LIF and integrin ανβ3 in endometrium during embryo implantation，which is conducive to the adhesion of blastocyst to endometrium，in order to improve endometrial receptivity.As the main active component of rhizoma drynariae，total flavonoids can also improve endometrial receptivity.

Keywords Rhizoma drynariael; Total flavone; Naringin; Endometrial receptivity; Homeobox A10; Leukaemia inhibitory factor; Integrin ανβ3

中圖分类号：R285.5;R271.41;R733.7文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.24.007

骨碎补本是著名的骨伤科常用中药，因其补肾气，行血脉，益筋骨，为名老中医肖承悰教授治疗子宫内膜容受性低的经验方——二补助育汤的君药之一。子宫内膜容受性与体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的成功与否具有较高相关性，通过中药来提高子宫内膜容受性逐渐成为被认可的治疗手段。针对二补助育汤开展的临床及实验研究取得了较好的研究结果[1-6]，但关于该方的生物活性及其影响子宫内膜容受性的确切作用机制仍在探索阶段，中药单体对药物机制探讨更有针对性。

骨碎补有补肾活血功用，骨碎补黄酮类化合物是其主要活性成分，柚皮苷为主要鉴定标准。故本实验选用骨碎补及其主要成分总黄酮、柚皮苷作为干预，以同源盒基因A10（Homobox Gene，HOX）、白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）以及整合素ανβ3等影响子宫内膜容受性的公认指标开展研究，初步确定骨碎补影响子宫内膜容受性的主要活性成分及作用机制，为后续相关研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用SPF级ICR小鼠（北京维通利华实验技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2012-0001），8～12周龄，体质量（25±2）g。对全部小鼠进行阴道涂片，检查动情周期，连续观察2个动情周期正常者。

1.1.2 药物

1）骨碎补：颗粒剂30 g、骨碎补总黄酮（强骨胶囊）（北京岐黄医药股份有限公司，国药准字Z20030007），购自北京中医药大学东直门医院药房;柚皮苷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：N1007345），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2）GnRHa{醋酸曲普瑞林注射液，达必佳[辉凌制药（Ferring GmbH），德国，进口批号H20100365]};注射用尿促性素（HMG，国药准字H20033108）;注射用绒促性素（HCG，国药准字H44020674）。以上药品均购自北京妇产医院。

3）戊酸雌二醇（补佳乐，法国DELPHARM Lille股份有限公司，进口批号：H20120368）;阿司匹林肠溶片（Bayer股份有限公司，国药准字J20130078）。以上药品均购自北京中医药大学东直门医院。

1.1.3 试剂 抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒REALTMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE，Dako Denmark A/S，货号K5007;LIF（稀释比1∶100;Novus，货号：NBP2-27406）;整合素ανβ3（稀釋比1∶100;Abbiotec，货号：251672）;引物序列及其内参磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）序列。见表1。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将实验动物分成7组，即：空白组、模型组、骨碎补组、骨碎补总黄酮组、柚皮苷组、西药组I（补佳乐组）、西药组II（阿司匹林组）。每组有小鼠10只。

造模方法：GnRHa+HMG+HCG。模型组，西药组I（补佳乐组），西药组II（阿司匹林组）、骨碎补组、骨碎补总黄酮组、骨碎补柚皮苷组，观察上述各组小鼠阴道涂片，以动情日为第1天，于每天上午9：00定时腹腔内注射达必佳（GnRHa）40  IU/100 g体质量，连续9 d，至第9天同时注射尿促性素（HMG）1 U/100 g体质量，48 h后注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）10 IU/100 g体质量，造成胚泡着床障碍模型。

1.2.2 给药方法 于造模同步为空白组和模型组小鼠每天灌服生理盐水0.2 mL，每日骨碎补组按0.03 g/20 g体质量、骨碎补总黄酮组按0.02 g/20 g体质量、骨碎补柚皮苷组按0.01 g/20 g体质量的各自相应浓度灌服（骨碎补以前期工作中取全方的中剂量，相当于临床成人剂量140 g/60 kg体质量，总黄酮及柚皮苷剂量以其在相关实验研究关报道的有效剂量范围取中值[7-8]），西药组I每日灌服补佳乐6 μg/20 g体质量（相当于临床体质量60 kg的成人剂量2 mg/60 kg），西药组II每日灌服阿司匹林225 μg/20 g体质量（相当于临床体质量60 kg的成人剂量75 mg/60 kg），连续10 d。

1.2.3 取材 在第11天处死小鼠（断颈），取各组小鼠子宫，一角迅速放入液氮，以qPCR对各组小鼠子宫内膜检测HOXA-10 mRNA的表达;另一角则于4%多聚甲醛中固定，以免疫组化HRP法，对各组小鼠子宫内膜测定LIF、整合素ανβ3的表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。各组间比较采用单因素ANOVA。相对定量2-△△CT法分析计算各个样本目的基因的表达。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠子宫内膜HOXA-10 mRNA表达情况

2.1.1 HOXA-10扩增曲线和溶解曲线 从图1和图2可以看出，各反应管的扩增效率相近，且未见非特异性扩增。

2.1.2 各组小鼠子宫内膜HOXA-10 mRNA表达情况 各组正态性检验P均大于0.10，均为正态（见表2）。方差齐性检验P=0.03<0.05，各组方差不齐，取Welch检验F′=6.603，P=0.011，P<0.05，各组间比较差异有统计学意义。多重比较后，模型组表达明显低于空白组（P=0.010）;与模型组比较，骨碎补组及总黄酮组小鼠子宫内膜HOXA-10 mRNA表达明显增加（与骨碎补组P=0.008，与总黄酮组P=0.009，P<0.05），与柚皮苷组差异无统计学意义;与西药组比较，骨碎补组、总黄酮组与补佳乐组差异无统计学意义（与骨碎补组P=0.218，与总黄酮组P=0.245，P>0.05），柚皮苷组与阿司匹林组差异无统计学意义（P=0.519>0.05）。

2.2 各组小鼠子宫内膜LIF表达情况

2.2.1 显微镜100倍观察到LIF在各组小鼠子宫内膜的表达 见图3。

2.2.2 各组小鼠子宫内膜LIF表达情况 在LIF表达中，各组正态性检验P均大于0.10，均为正态。方差齐性检验P=0.260>0.05，各组方差齐。ANOVA检验F=95.217，P=0.000，P<0.05，各组间比较差异有统计学意义。多重比较后，模型组小鼠子宫内膜LIF表达明显低于空白组（P=0.000）;与模型组比较，骨碎补组、总黄酮组及柚皮苷组小鼠子宫内膜LIF表达明显增加（P均等于0.000，P<0.05）;与西药组比较，骨碎补组子宫内膜LIF表达与阿司匹林组差异无统计学意义（P=0.488，P>0.05），但低于补佳乐组（P=0.006，P<0.05）;总黄酮组与骨碎补组比较差异无统计学意义（P=0.084，P>0.05）。

2.3 各组小鼠子宫内膜整合素ανβ3表达情况

2.3.1 显微镜200倍观察到整合素ανβ3在各组小鼠子宫内膜的表达 见图4。

2.3.2 各组小鼠子宫内膜整合素ανβ3表达情况   模型组小鼠子宫内膜整合素ανβ3表达明显低于空白组（t=-7.355，P=0.000）;与模型组比较，骨碎补组小鼠子宫内膜整合素ανβ3表达明显增加（t=2.684，P=0.017，P<0.05），而总黄酮组及柚皮苷组差异无统计学意义（P>0.05，分别为t=-1.775，P=0.095，t=1.651，P=0.119）;骨碎补组与西药组比较，差异无统计学意义（骨碎补与补佳乐t=-1.781，P=0.093>0.05，骨碎补与阿司匹林t=-1.321，P=0.205>0.05）。见表4。

在小鼠子宫内膜整合素ανβ3表达面积的对比中，总黄酮组及柚皮苷组与模型组比较差异均无统计学意义，所以针对小鼠子宫内膜整合素ανβ3表达的积分光密度值（OD值），做进一步比较。与模型组比较，总黄酮组OD值明显增加（P<0.05），柚皮苷组差异无统计学意义。见表5。

3 讨论

3.1 HOXA10、LIF及整合素ανβ3与子宫内膜容受性的关系 因本研究以单味药及其成分作为干预手段，实验结果不如全方，而且侧重于活性成分的初步探索，而并非子宫内膜容受性的调节机制的因素探究，所以选用目前公认的、可视为标志性、并非探索性的指标进行研究，即HOXA 10、LIF和整合素ανβ3。

HOXA10的表达已被普遍认为与子宫内膜容受性具有密切关系，其以调节因子的身份在胞饮突形成、子宫内膜容受性和胚胎植入等的建立过程中必不可少[9]。

LIF在胚胎移植中的子宫转变为接受状态、蜕膜化、胚泡生长、胚胎-子宫内膜相互作用，以及免疫调制等诸多过程中均发挥重要的作用[10]，LIF被认为是种植着床预测的金标准。

整合素ανβ3表达于子宫内膜腺上皮的时间与植入窗期一致，子宫内膜中低水平的整合素ανβ3与子宫内膜容受性下降有关[11]，其作为细胞黏附分子，是衡量子宫内膜容受性的一个公认指标。

3.2 骨碎补及其主要成分与子宫内膜容受性的关系 骨碎补原本是著名的一味骨伤科常用中药，性味苦、温，入肝、肾经，功用补肾、活血，主治肾虚腰痛、跌打闪挫、骨伤、风湿痹痛。二补助育汤为肖承悰教授治疗子宫内膜容受性低的经验方，骨碎补就作为其君药之一。全方补肾气，通胞脉，临床应用取得良好疗效[2-3]。

骨碎补的相关研究多集中于总黄酮和柚皮苷[7-8，12-14]。黄酮类化合物是骨碎补药材的主要活性成分[12]。骨碎补总黄酮为天然的植物雌激素源，如强骨胶囊，即是以其为有效成分开发的药品。在鉴定方面，除形态特征外，中药骨碎补的鉴定标准多参照柚皮苷的含量。骨碎补中的柚皮苷是其中重要的二氢黄酮类化合物，能够发挥多种药理活性作用，如成骨细胞诱导、抗过敏、抗病毒、抗氧化等[12]。在现代药理学研究中，柚皮苷具有显著的植物雌激素作用[15]。

本实验结果显示，骨碎补组及总黄酮组小鼠子宫内膜HOXA-10 mRNA表达明显增加，柚皮苷组与西药组差异无统计学意义;LIF表达方面，骨碎补组、总黄酮组及柚皮苷组均明显增加;整合素ανβ3，骨碎补组能明显提高表达，与西药组差异无统计学意义，总黄酮能明显提高OD值，使内膜光密度增加，柚皮苷差异无统计学意义。

故我们推测，骨碎补改善子宫内膜容受性的作用机制为上调HOXA-10 mRNA、LIF及整合素ανβ3的表達。总黄酮作为骨碎补药材的主要活性成分，亦可改善子宫内膜容受性，而作为鉴定主要成分的柚皮苷，可能因为剂量问题，在此实验中体现的疗效有限。

关于骨碎补对子宫内膜容受性直接影响，目前尚未有相关报道，骨碎补在妇科方面最多见于妇女骨质疏松的研究，所以没有在子宫内膜容受性方面可行的骨碎补有效成分及用量可参考。本实验初步探索，为此提供了依据，今后可将骨碎补有效成分细化，并设立梯度，开展进一步研究。

参考文献

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（2020-03-24收稿 责任编辑：苍宁）

基金项目：国家自然科学基金项目（81473721）;国家中医药管理局全国名老中医肖承悰教授学术经验研究及传承工作室作者简介：石玥（1988.02—），女，博士，医师，研究方向：中医妇科，E-mail：october5845@163.com通信作者：刘雁峰（1963.02—），女，博士，主任医师，博士研究生导师，研究方向：中医妇科，Tel：（010）84013157，E-mail：liuyaf8888@sina.com