刘露露，汪军成，，姚立蓉，，孟亚雄，，李葆春，杨 轲，司二静，，王化俊，，马小乐，**，尚勋武，李兴茂

(1.甘肃农业大学农学院 兰州 730070；2.甘肃省干旱生境作物学重点实验室 兰州 730070；3.甘肃省农业科学院旱作农业研究所 兰州 730070)

磷素对植物生长发育至关重要[1-2]，参与多种代谢途径如蛋白活化、信号传导等。而我国60%以上的土壤有效磷匮乏，通常是通过增施磷肥来缓解该现状，但大部分被Ca2+、Fe3+、Mn2+等金属离子固定在土壤中，从而造成土壤酸碱失衡和生态污染[3-5]。另外，农业生产所用磷肥为不可再生资源，随着农业对磷肥需求量的不断增加，磷矿将在未来50～200年面临枯竭[6-7]。因此，为了应对未来缺磷对农业生产带来的危机，研究作物的磷胁迫响应机制和培育耐低磷品种显得尤为重要。

小麦(Triticum aestivumL.)是重要的粮食作物之一，在我国小麦是最重要的商品粮和战略储备粮，在粮食生产以及流通和消费领域具有重要地位。但通过超量施用化肥达到小麦高产的目的有悖于“绿色农业”和“可持续发展农业”的号召。为了响应我国“双减农业”政策，降低小麦生产中磷肥的施用量，减少生态污染，耐低磷小麦种质的培育显得尤为重要。目前关于耐低磷种质资源的筛选与评价在水稻(Oryza sativaL.)、玉米(Zea maysL.)、小麦、谷子(Setaria italicaL.)等作物中已有研究[8-11]。耐低磷品种通常是采用苗期生物学性状、成株期株高、千粒重等性状和酸性磷酸酶活性等指标进行筛选、鉴定和评价[13]。但上述研究主要是针对苗期或成株期单一生育期的耐低磷能力特性评价，有的采用大田和土培试验，肥力和水分难以控制一致，试验结果存在不确定性。在小麦耐低磷种质的筛选中，通常采用苗期筛选体系，因苗期磷素营养状况直接影响小麦的生长发育，最终导致产量和品质下降，且苗期筛选成本较低，再结合成株期盆栽试验能更加准确、有效地评价小麦的耐低磷特性[14-15]。但综合考虑小麦苗期与成株期的耐低磷特性的研究鲜见报道。

本研究对春小麦苗期及成株期的耐低磷能力进行综合筛选、鉴定和评价，苗期通过种子萌发袋筛选试验对162 份春小麦的形态指标进行统计分析，以期筛选出苗期耐低磷候选材料和低磷敏感候选材料，并对其进行盆栽苗的成株期鉴定，最终筛选出苗期和成株期耐低磷材料和磷敏感材料，并进一步分析其在低磷胁迫下酸性磷酸酶的活性变化，旨在为进一步研究小麦耐低磷特性、培育耐低磷品种提供理论依据和种质资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为甘肃农业大学农学院麦类遗传育种实验室提供的162 份春小麦种质资源。

1.2 试验设计

每份材料挑选籽粒饱满且大小一致的种子，用5% NaClO 溶液消毒5 min，之后用蒸馏水冲洗3 次，再将种子放入铺有滤纸的培养皿中萌发12 h，然后将露白的种子接入种子萌发袋[规格为18 cm(高)×12.5 cm(宽)]的纸芯上，每袋5 粒；设正常磷处理(0.2 mmol·L–1)和低磷胁迫处理(0.02 mmol·L–1)，3 次重复。以KH2PO4为磷源，同时在低磷胁迫的营养液中加入0.18 mmol·L–1的KCl 补足K 元素，pH 为6.8±0.1，其余营养液[16]成分均相同；每个种子袋中初始加入20 mL 该营养液，待种子接入5 d 后，每3 d 加5 mL 营养液。培养条件参考Ren 等[17]。共培养30 d 后，每重复挑选3 株有代表性的小麦幼苗采用根系扫描仪(Epson，Long Beach，CA，USA)和WinRHIZO 软件(Quebec，QC，CAN)计算根系相关指标[18]，同时测量地上部与根系的干重，并计算根冠比。

1.2.2 盆栽试验

种子处理和营养液配比同种子萌发袋试验。将种子接入盛有8 L 沙子和蛭石(体积比为1∶2)的花盆中，每盆5 株，在室外按照完全随机区组试验设计摆放。待其生长 7 d 后，进行正常磷处理(0.2 mmol·L–1)和低磷胁迫处理(0.02 mmol·L–1)，每次5 株，3 次重复，共计15 株，其余管理均相同。成熟后收获每个重复所有植株的地上部分测量不同处理的总分蘖数、无效分蘖数、株高、穗长、不孕小穗数、穗粒数、株粒重、地上部干物质、千粒重、粒长和粒宽等性状。

1.2.3 水培试验

对上述筛选的耐低磷材料和磷敏感材料进行水培试验，培养环境和营养液的配比同种子萌发袋试验，设3 次重复，每重复选取3 株长势一致且具有代表性的小麦幼苗，分别在胁迫3 d、7 d、14 d、21 d、30 d 测定地上、地下部干重和根系与叶片组织中酸性磷酸酶的活性变化。

1.2.4 酸性磷酸酶(APase)活性测定

膨胀土在干湿循环的作用下会发生不可逆的胀缩变形，一旦这种变形受到限制，就会产生膨胀力，这是研究膨胀土问题的一个关键因素。当然，对于膨胀土边坡而言，除了膨胀力以外，还有其他因素也在同时影响着膨胀土边坡的稳定性。大量实际工程发现，土坡在失稳之前，边坡上往往会出现一定的裂隙，随着裂隙的发展，边坡的稳定性会随之降低[11]。因此，在了解了膨胀土边坡破坏过程中的变形特征的基础上，分析膨胀土边坡在裂隙、膨胀力和降雨历时影响下的安全系数的变化趋势，从而了解这些因素对膨胀土边坡稳定性的影响。

参照Liu 等[19]方法测定叶片和根组织中APase活性，APase 活性以单位时间内单位质量的根或叶生成的对硝基苯酚(PNP)的量来表示[μg·g–1·h–1(FW)]。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010 和GraphPad Prism 6.01、R 语言分析作图，利用SPSS 19.0 进行数据分析，采用隶属函数法对小麦苗期和成株期进行耐低磷综合评价，参考相关文献[11]计算指标。

式中：µ(Xj)为第j个综合指标的隶属函数值，Xj为第j个综合指标值，Xmax为第j个综合指标的最大值，Xmin为第j个综合指标的最小值。

式中：Wj为第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度及权重，Pj为各品种第j个综合指标的贡献率。

式中：D为在低磷胁迫条件下各品种耐低磷能力的综合评价值。

2 结果与分析

2.1 春小麦苗期耐低磷种质的筛选

2.1.1 耐低磷系数的相关性分析

通过测定苗期不同磷素处理下的地上部及地下部的各个指标，计算出相应指标的耐低磷系数，并对其进行相关性分析(表1)。结果表明：地上部干重与地下部干重的耐低磷系数呈极显著正相关，与根冠比的耐低磷系数呈极显著负相关；株高与总根长和地上部干重的耐低磷系数呈极显著正相关，与根表面积和地下部干重的耐低磷系数呈显著正相关；根长与根表面积的耐低磷系数呈极显著正相关，与总根长、根体积、地上部干重和地下部干重的耐低磷系数呈显著正相关；总根长、根表面积、根体积、地上部干重和地下部干重 5 个指标的耐低磷系数两两之间均存在极显著正相关。

表1 供试春小麦材料苗期各生长性状耐低磷系数的相关性Table1 Correlation among low phosphorus tolerance coefficients of growth indicators at seedling stage of the tested spring wheat materials

2.1.2 主成分分析

对供试材料苗期各项指标的耐低磷系数进行主成分分析[20]，以特征值0.9为提取临界值，共提取4个主成分(表2)。第1主成分的贡献率最大，为44.30%，主要为反映根系因子的根表面积、根体积、地下部干重等指标；第2主成分载荷较高的是根冠比，贡献率为15.06%；第3主成分载荷较高的是株高，贡献率为11.78%；第4主成分载荷较高的是根长，贡献率为11.46%。前4个综合指标的累计贡献率达82.60%，可以代表苗期8个指标的绝大部分信息，因此将原始数据中的8个指标转化为4个相互独立的综合指标，后续将利用这4个指标对供试材料苗期耐低磷能力进行综合分析。

表2 供试春小麦材料苗期各生长指标耐低磷系数载荷矩阵、指标特征值及贡献率Table2 Load matrix，characteristics value and contribution rate of low phosphorus tolerance coefficient of each growth indicator of the tested spring wheat materials at seedling stage

2.1.3 耐低磷能力的聚类分析

以2.1.2 提出的综合指标为基础，采用隶属函数法，计算出各供试春小麦材料苗期耐低磷综合评价值D值(表3)，D值越大表示其耐低磷能力越强，D值越小表示其耐低磷能力越弱；然后基于D值进行聚类分析(图1)。结果表明，供试材料可被分为4 类，第Ⅰ类包含 10 份材料，占 6.17%，D值范围为0.448 2～0.592 6，为耐低磷品种，其中品种wp-26、wp-29、wp-35、wp-72、wp-139 的D值依次为最高，为耐低磷候选材料；第Ⅱ类包含26 份材料，D值范围为0.322 4～0.414 8，为较耐低磷品种；第Ⅲ类包含91 份材料，占56.17%，D值范围为0.197 3～0.315 1；第Ⅳ类包含材料35 份材料，D值范围为0.083 3～ 0.192 6，其中wp-32、wp-33、wp-119、wp-141 的D值最小且耐低磷能力最弱。

表3 不同春小麦材料苗期的耐磷综合评价值(D)及耐低磷类型Table3 Comprehensive evaluation value (D) and low phosphorus tolerance types of seedlings of different spring wheat materials

续表3

2.2 春小麦成株期耐低磷种质的鉴定

为了鉴定苗期种子萌发袋试验结果的可靠性，进一步对苗期筛选的耐低磷材料(5 份)和磷敏感材料(4 份)进行盆栽成株期特性分析(图1)，结果显示，低磷胁迫对耐低磷候选材料的长势影响较小，而对磷敏感候选材料的生长抑制作用较大，主要表现出植株矮小、分蘖减少和结实率下降等明显的缺素症状。

图1 耐低磷基因型与低磷敏感基因型小麦材料在成株期的长势情况Fig.1 Growth situation of wheat materials of low phosphorus tolerant and sensitive genotypes at maturity

对不同磷处理下10 个成株期指标进行主成分分析(表4)，结果表明第1 主成分的贡献率最大，为40.21%，其主要包含株高、穗长、地上生物量、株粒重等性状；第2 主成分的贡献率为26.06%，其中载荷较高的是株粒数、总分蘖数；第3 主成分的贡献率为16.96%，其中载荷较高的是穗粒数。前3 个综合指标的累计贡献率达83.23%，利用这3 个相互独立的综合指标对苗期筛选出的9 份春小麦的耐低磷能力进行评价。

对上述的3 个综合指标采用隶属函数法，计算所筛选9 份春小麦的综合评价值D值(表5)，并对D值进行聚类分析(图2)，结果表明，供试材料被分为2 类：第1 类包含5 份材料，其中综合评价值最高的为wp-35，即耐低磷能力最强；第2 类包含4份材料，其中wp-119 的综合评价值最低，即耐低磷能力最弱。

2.3 耐低磷基因型wp-35 和磷敏感基因型wp-119在低磷胁迫下根系和叶片干重和酸性磷酸酶活性的变化

干物质作为植物苗期生长情况的重要考量指标，不仅能反映各非生物胁迫对植物生长过程中的综合影响，还能在特定条件下考量其对植物长势的影响。对耐低磷材料wp-35 和磷敏感材料wp-119 进行水培试验，分别在胁迫3 d、7 d、14 d、21 d、30 d测定地上部与根系干重的变化。由图3A 可知，与对照相比，在低磷胁迫下，wp-35 和wp-119 在7 d 以前对叶片干重影响较小，在7 d 以后小麦苗期根系和叶片的干物质积累均受到不同程度影响，总体呈现下降的趋势；wp-35 在胁迫21 d 地上部开始下降，到胁迫30 d 达到极显著下降；而wp-119 在胁迫14 d后与对照相比显著下降。由图3B 可知，wp-35 在低磷胁迫后总体下降幅度较小，而wp-119 在低磷胁迫7～14 d 根系的干重高于对照，在胁迫30 d 后，其根系干重显著下降，说明在低磷胁迫7 d 时，wp-119 对外界缺磷环境做出响应，以增加外界磷素的获取，而在胁迫30 d 时，缺磷环境下的小麦难以维持根系的快速生长，呈显著下降。

表4 供试春小麦材料成株期各综合指标的载荷矩阵、指标特征值及贡献率Table4 Load matrix，index characteristic value and contribution rate of each comprehensive index at adult stage of spring wheat materials

表5 供试春小麦材料成熟期的综合性状指标值、权重、μ(X)及综合评价值(D)Table5 Comprehensive index，index weight，μ(X) and comprehensive evaluation value (D) of the spring wheat materials at maturity stage

图2 基于种子袋筛选结果的春小麦材料成株期的耐低磷性聚类图Fig.2 Low phosphorus tolerance clustering diagram of spring wheat material during the whole growth period based on screening results

从图4A 可知，低磷胁迫处理30 d，小麦根系组织内的APase 活性均升高，但不同磷效率小麦升高幅度存在差异。磷敏感品种wp-119 升高幅度较小，缺磷处理为正常磷处理的 1.77 倍，耐低磷品种wp-35 APase 活性升高幅度最大，为正常磷处理的1.97 倍。总体来看，随着磷胁迫程度的不断加深，小麦根系组织内APase 活性不断上升。

图3 春小麦耐低磷基因型wp-35 和磷敏感基因型wp-119 在不同磷水平处理下地上部(A)和根系(B)干重变化Fig.3 Changes in dry weight of shoots (A) and roots (B) of spring wheat material wp-35 (low phosphorus tolerant) and wp-119 (low phosphorus sensitive) under different phosphorus levels

从图4B 来看，在低磷胁迫3 d 和7 d 时，wp-35在对照和低磷处理下叶片 APase 活性增幅分别为28.53%和30.85%，而wp-119 增幅分别为24.75%和44.33%；在低磷胁迫处理14 d、21 d 和30 d 时wp- 35 和wp-119 叶片APase 活性均呈上升趋势，且wp- 35 的APase 活性更高。总体来看，叶片中的APase活性随着处理时间的延伸不断提高，且达到显著性水平。

2.4 耐低磷基因型wp-35 和磷敏感基因型wp-119在不同磷水平处理下成株期的特征变化

为进一步分析耐低磷基因型wp-35 和磷敏感基因型wp-119 在低磷素胁迫下成株期的特征变化，测定了其在不同磷浓度处理下的形态和经济指标。结果表明：低磷胁迫对两品种粒宽(图5A)的影响较小，且未达显著水平；而对于粒长、千粒重和株高而言(图5B、5C、5D)，wp-35 的株高、粒长、千粒重在低磷胁迫下较对照分别下降2.38%、4.55%和9.41%，而wp-119 的降幅高达15.36%、15.78%和24.05%，并且wp-119 的粒长、千粒重和株高在低磷胁迫下与对照相比达显著差异。而对于地上生物量、穗长、穗粒数、单株粒重而言(图5E、5F、5G、5H)，两品种与对照相比都呈显著性下降，缺磷对其影响都较大。从上述各指标在不同磷处理条件下的变化看，低磷胁迫不同程度上影响了wp-35 和wp-119 的正常生长，其中对wp-119 的影响较大。

图4 春小麦耐低磷基因型wp-35 和磷敏感基因型wp-119 在不同磷水平处理下根系(A)和叶片(B)APase 活性变化Fig.4 Changes of APase activity in roots (A) and leaves (B) of spring wheat material wp-35 (low phosphorus tolerant) and wp-119 (low phosphorus sensitive) under different phosphorus levels

图5 春小麦耐低磷基因型wp-35 和磷敏感基因型wp-119 在不同磷水平处理下形态和经济性状的变化Fig.5 Changes of morphology and economic traits of spring wheat material wp-35 (low phosphorus tolerant) and wp-119 (low phosphorus sensitive) under different phosphorus levels

3 讨论

小麦的耐低磷特性是一个复杂的综合性状，主要涉及植株对磷元素的吸收转运和利用等，与植株的形态结构和生理生化等性状密切相关。苗期又是作物营养吸收的瓶颈期和筛选耐性指标的关键时期[20]。苗期初筛不仅能快速、准确地鉴定和筛选耐低磷品种，还可明显地减少田间筛选的工作量与成本[21]；而盆栽试验被认为是进行养分胁迫筛选试验最简便有效且精确度较高的方法[22]。但综合考虑小麦苗期与成株期耐低磷性鉴定评价鲜有报道。本研究分别选取小麦苗期与成株期耐低磷胁迫相关指标，将其结合起来，采用综合评价方式分析，结果显示苗期和成株期各指标受低磷胁迫影响的程度有所不同，且各指标间存在一定程度的相关性。故此，直接利用这些指标难以客观、准确地评价小麦种质资源的耐低磷特性，从而影响耐低磷特性鉴定结果。通过主成分分析，将苗期8 个和成株期10 个指标分别转化成4 个和3 个新的相互独立的综合指标，使评价工作简化且客观准确，然后采用隶属函数法对苗期162 份春小麦材料的耐低磷特性进行研究，发现供试材料可被聚为4 类：耐低磷型、较耐低磷型、低磷较敏感型和低磷敏感型，从中筛选苗期耐低磷候选材料5 份和磷敏感候选材料4 份，并进一步对其采用盆栽方法进行成株期鉴定，最后共同鉴定出耐低磷材料wp-35 和磷敏感材料wp-119，同时发现wp-26 为苗期耐低磷品种成株期磷敏感品种，wp-141 为苗期磷敏感品种成株期耐低磷品种，这可能是小麦苗期和成株期在耐低磷特性方面的遗传机制不同所致。因此，就小麦不同磷效率基因型的筛选而言，仅仅只凭苗期来筛选耐低磷材料很难对复杂的小麦耐低磷能力进行全面确定，需结合盆栽和水培的方法做进一步的鉴定分析，才能筛选得苗期和成株期相统一的耐低磷材料，为后续研究提供可靠的材料支持。

磷素是植物体内核酸、植素和卵磷脂的组成成分，在能量代谢、糖分代谢和光合作用等代谢过程中起重要作用，很大程度上决定了作物的最终产量和品质[23]。在磷胁迫条件下，小麦的根干重、地上部干重、增产潜力均受到不同程度的影响[24]。本研究发现在低磷胁迫下苗期地上部干重和根系干重均受到明显的抑制作用，且磷敏感材料较耐低磷材料降幅更大，可能是因为耐低磷材料对磷素的吸收与转运高于磷敏感材料；成株期株高、粒长、粒宽、千粒重穗长、穗粒数、单株粒重、地上生物量等形态和经济指标与对照相比均明显下降，其中耐低磷材料wp-35 的株高、粒宽和千粒重等性状与对照相比下降较小，而磷敏感材料wp-119 与其对照相比达显著差异，株高、粒宽和千粒重等性状可以作为区分小麦不同耐低磷特性的重要指标，说明低磷会限制小麦的生长发育，严重影响经济产量，且对磷敏感材料的影响远大于耐低磷材料，进一步说明材料的可靠性。

APase 是一种适应性诱导酶，低磷胁迫对细胞内的APase 活性有明显的诱导作用，其生理意义可能是增加对植物体内有机磷化合物的水解，以促进其体内磷源的再利用，以提高磷素的利用效率[25]。如耐低磷基因型小麦‘小偃54’在低磷胁迫下可以通过提高根系APase 活性来增加磷素吸收[26]。本研究发现，低磷处理 14 d，小麦根系和叶片组织内的APase 活性大幅升高，耐低磷品种wp-35 升高幅度大于磷敏感品种wp-119，植物体内的APase 具有将有机磷转化为无机磷的能力，故推测植物体内APase 活性与植物体内磷素的再利用有关。表明低磷胁迫对不同基因型小麦根系酶活性具有不同的调控作用，耐低磷品种和低磷敏感性品种在低磷胁迫下的响应存在差异，因而再利用作物体内磷素的能力也不同。本研究与烟草(Nicotiana tabacum)[27]和玉米(Zea mays)[28]等有关APase 活性研究结果相一致。

4 结论

本研究首先对162 份春小麦种质的苗期耐低磷特性进行研究，筛选出苗期耐低磷候选材料和磷敏感候选材料，进一步对其采用盆栽方法进行成株期鉴定，最终筛得苗期和成株期共同耐低磷材料wp-35 和磷敏感材料wp-119。其中不同磷效率基因型的APase 对低磷胁迫的响应程度也不同，根系和叶片系统中的APase 活性wp-35 普遍高于wp-119，进一步说明wp-35 对低磷环境具有更强的适应性。该研究结果可为研究小麦耐低磷特性、培育耐低磷品种提供理论依据和种质资源。