张伟莉 张丽光 杨慧杰 王吉祥 郭平毅 原向阳

(1山西农业大学农学院，山西 太谷 030801；2山西省农业科学院作物科学研究所，山西 太原 030031)

谷子抗旱、耐瘠、适应性强，是山西省“杂粮王国”的典型代表，也是我国特色和优势出口作物[1]。 谷子种子较小，苗期生长缓慢，田间杂草严重影响其产量和品质。 相对于除草剂在水稻、小麦、玉米、大豆等作物田间的应用技术来说，谷子田间化学除草研究刚刚起步。

阔世玛(Sigma Broad)，通用名:二磺·甲碘隆，是德国拜耳作物科学有限公司推出的高效苗后选择性除草剂，可以防除绝大多数禾本科(恶性)杂草及部分阔叶杂草，并在小麦田间得到了较好应用[2]。 汤露萍等[3]研究表明，世玛油悬浮剂加助剂和阔世玛水分散粒剂加助剂对宁麦9 号生长较安全，除草效果好。 而王伟[4]等研究表明，在拔节后喷施世玛，冬小麦倒二叶的初始荧光(original fluorescence，Fo)升高，而最大荧光(maximum fluorescence，Fm)和最大光化学产量(maximum photochemical yield，Fv/Fm)降低，说明世玛等除草剂对冬小麦的安全性受喷药时期和小麦品种的影响。 喷施阔世玛后，紫苏叶片中的叶绿素含量降低，光合作用受到抑制[5]。 若能将阔世玛安全地应用到谷子上，将对谷子田间的化学除草和现代生产具有重要意义。 黄蕾等[6]和杨慧杰等[7]认为，阔世玛显著降低了谷子的株高、叶面积、光合色素含量和生物重，严重影响其生长发育。 谷子受到胁迫后，不仅会对其生长发育产生影响，而且会降低其光合作用的效率。 谷子是 C4植物， 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC)、丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate orthophos-phate dikinase，PPDK)、苹果酸脱氢酶(NADP-malate dehydrogenase，NADPMDH)和苹果酸酶(NAD-malic enzyme，NAD-ME)是其光合过程中的关键酶，影响着CO2的固定还原和光合同化力的形成。 在亚适温弱光下黄瓜幼苗的净光合速率(net photosynthetic rate，Pn)和气孔导度(tomatal conductance， Gs) 显著降低，但胞间 CO2浓度(intercellular CO2concentration，Ci)略有上升，并且会影响暗反应，对光系统影响较小，碳同化酶活性的降低造成光合功能的下降[8]。 而在不同剂量的砜嘧磺隆(宝成)、莠去津处理下，玉米叶片的PEPC、PPDK、NADP-MDH 和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase，Rubisco)活性均受到不同程度的抑制[9]。 目前，关于阔世玛对谷子光合特性的研究较少。 本试验以常规谷子晋谷21 号和高产杂交谷张杂谷5 号为试验材料，系统研究不同浓度阔世玛对谷子叶片气体交换参数、叶绿素荧光参数、光合关键酶活性及可溶性物质含量的影响，以明确其影响谷子光合作用的生理机制，为阔世玛在谷子田间的安全使用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种:常规优质谷子晋谷21 号和高产杂交谷张杂谷5 号，分别由山西省农业科学院经济作物研究所和河北省张家口市农业科学院提供。

供试药剂:3.6%阔世玛水分散粒剂，由德国拜耳作物科学公司提供。

1.2 试验设计

试验在山西农业大学温室进行，采用完全随机设计，在13 cm×15 cm 的营养钵(土沙比例为2 ∶1)中分别种植张杂谷5 号和晋谷21 号，3 次重复。 每个营养钵播种30 粒种子，三叶期进行间苗，留取长势均匀一致的5颗幼苗备用。 在谷子五叶期，叶面均匀喷施不同浓度[7.5 mg·L-1(S1)、15 mg·L-1(S2)、30 mg·L-1(S3，推荐浓度)、60 mg·L-1(S4)]的阔世玛溶液(加助剂烷基乙基磺酸盐0.4%)，至叶片完全湿润为止，并设置无助剂清水作为对照(CK)。 施药后7 d，选取长势一致的谷子幼苗叶片，测定气体交换参数、叶绿素荧光参数、碳同化关键酶活性以及糖含量等指标。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 气体交换参数测定 采用CI-340 便携式光合仪(美国思爱迪)测定气体交换参数，在晴朗无风的天气，选取有代表性的倒二叶测定Pn、蒸腾速率(transpiration rate，Tr)、Gs 和Ci 等。 测定光强设为1 000±50 μmol·m-2·s-1，CO2浓度同外界大气浓度，叶片温度在25～30℃之间。

1.3.2 叶绿素荧光参数测定 叶绿素荧光参数的测定采用DUAL-PAM-100 双通道调制叶绿素荧光仪(德国WALZ 公司)，将谷子叶片置于暗处暗适应30 min 后，测定Fo、Fm、Fv/Fm，Fv/Fm＝(Fm-Fo)/Fm、表观光合电子传递速率(apparent photosynthetic electron transport rate， ETR)、调节性能量耗散量子产量[quantum yield dissipated by regulatory energy， Y(NPQ)]及非调节性能量耗散量子产量[quantum yield dissipated by non-regulatory energy，Y(NO)]等参数。

1.3.3 碳同化关键酶活性测定 PEPC 活性测定:根据萧浪涛等[10]的方法加以改进，取谷子叶片0.2 g，加入提取介质，在2℃条件下，15 000×g离心20 min，检测340 nm 波长处吸光度值。 NADP-MDH 活性测定:根据陈利[11]的方法并进行改进，加入100 mmol·L-1Tris-H2SO4缓冲液，在4℃条件下，15 000×g离心20 min，测定340 nm 波长处的吸光度值。 NAD-ME 活性测定:加2 mL 预冷的提取介质，在4℃条件下，15 000×g离心20 min，测340 nm 波长处的吸光度值，加入0.1 mL 150 mmol·L-1L-苹果酸，每隔30 s 测一次，共测2 min[11]。 Rubisco 活性测定:根据萧浪涛等[10]的方法加以改进，加2 mL 预冷的提取介质，在2℃条件下，15 000×g离心20 min，弃沉淀，上清液为粗酶提取液。以不加粗酶液的为空白对照，测定340 nm 波长处的吸光度值为E0；再加入10 mmol·L-1RuBP，同时计时，每隔30 s 测定一次吸光度值E1，测1 min。 PPDK 活性测定:在4℃条件下，15 000×g离心20 min，以蒸馏水为空白对照，测定340 nm 波长处的吸光度值为E0；再加入0.1 mL 30 mmol·L-1焦磷酸钠，同时计时，每隔30 s 测定一次吸光度值，共测2 min，根据吸光度值的变化计算酶活力。

1.3.4 糖含量测定 还原糖含量测定:采用3，5-二硝基水杨酸法[12]，准确称取0.1 g 谷子叶片，加入5 mL 80%乙醇，研磨后混匀，置于80℃恒温水浴中保温30 min，3 500×g离心10 min，再吸取5 mL 80%的乙醇对滤液进行提取，合并所有上清液至25 mL 容量瓶，定容，此为提取液。 取提取液和3，5-二硝基水杨酸(DNS)各2 mL 于试管中，水浴加热5 min，在540 nm波长处测定吸光度值。

蔗糖含量测定:采用3，5-二硝基水杨酸比色法[12]。 精确吸取上述测定还原糖含量的糖分提取液5 mL，加5 mL 6 mol·L-1盐酸，摇匀，在沸水浴中加热10 min，冷却后加入一滴酚酞指示剂，用10% NaOH 中和至溶液微红，然后转入25 mL 容量瓶中空容，为待测液。 取待测液和DNS 各2 mL 于试管中，水浴加热5 min，待冷却后在520 nm 波长处测定吸光度值。

淀粉含量测定:参考高俊凤[12]的方法并加以改进。 将上述还原糖提取过程中谷子叶片的沉淀物中加入2 mL 蒸馏水，沸水中糊化15 min，冷却后加入2 mL 9.2 mol·L-1HClO4，混匀，15 min 后加蒸馏水4 mL，4 000×g离心10 min，将上清液转入容量瓶中。 再向沉淀加入2 mL 4.6 mol·L-1HClO4，再次提取15 min，加入蒸馏水5 mL，离心后将上清液转入容量瓶，用蒸馏水洗涤后沉淀2 次，每次5～6 mL 合并定容，为淀粉提取液。 取2 mL 淀粉提取液与5 mL 蒽酮-H2S04于试管中，水浴加热10 min，冷却后于520 nm 波长处测定吸光度值。

可溶性蛋白测定:采用考马斯亮蓝G-250 染色法[12]。 称取0.2 g 叶片研磨，用蒸馏水定容至10 mL，取2～3 mL 匀浆液于离心管中，4 000×g 离心10 min，吸取上清液，加入0.5 mL 蒸馏水和5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，充分混合后放置2 min，在595 nm 波长处比色。

1.4 数据处理

所有图表均采用Excel 2007 进行处理，采用DPS 6.5 软件进行数据分析和处理，采用Duncan 新复极差法进行分析比较。

2 结果与分析

2.1 阔世玛对谷子幼苗叶片气体交换参数的影响

由图1 可知，2 个谷子品种叶片的Pn、Tr、Gs 均随阔世玛浓度的增加而降低，Ci 变化趋势相反。 除张杂谷5 号的Tr 在S1 与S2 间差异不显著外，晋谷21 号和张杂谷5 号的Pn 和Tr 在各处理间均差异显著。 2个品种的Gs 在S3 与S4 间差异不显著，其他各处理间均差异显著。 张杂谷5 号的Ci 在S2 与S3 间差异不显著；晋谷21 号的Ci 在S1 与S2、S2 与S3 间差异不显著，S1 与S3 间差异达显著水平。

图1 阔世玛对谷子幼苗叶片净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2 浓度的影响Fig.1 Effect of Sigma Broad on net photosynthetic rate， transpiration rate， stomatal conductance and intercellular CO2 concentration in leaves of foxtail millet

2.2 阔世玛对谷子幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

由表1 可知，张杂谷5 号和晋谷21 号谷子叶片的Fm、Fv/Fm和ETR 均随着阔世玛浓度的增加而降低，Fo则升高。 张杂谷5 号S1 ～S4 叶片的Fv/Fm分别较CK 显著下降7.27%、10.91%、18.18%和25.45%，Fo较CK 显著升高9.09%、9.09%、12.12%、18.18%，S2、S3、S4 叶片的Fm和ETR 均与CK 差异显著，S1 则与CK 间差异不显著。 晋谷21 号S1 ～S4 各处理的ETR分别较CK 显著降低39.33%、57.58%、64.12%、66.87%；S1、S2 的Fv/Fm与CK 间均无显著差异，S1的Fo与CK 相比差异不显著，Fm在各处理间均无显著差异。

张杂谷5 号和晋谷21 号叶片中的Y(NO)随着阔世玛浓度的增加而降低，而Y(NPQ)则升高(图2)。 2个品种S1 ～S4 谷子叶片的Y(NO)分别较CK 降低6.61%、7.18%、9.05%、13.22% 和5.60%、5.75%、8.55%、11.20%；而Y(NPQ)分别较CK 升高0.69%、0.94%、 2.06%、 3.08% 和 0.43%、 2.66%、 3.68%、6.77%。 说明通过增加PSⅡ天线色素的热耗散，阔世玛对光合作用的影响在一定程度有所缓解。

表1 阔世玛对谷子幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响Table 1 Effects of Sigma Broad on chlorophyll fluorescence parameters in leaves of foxtail millet

图2 阔世玛对谷子幼苗叶片Y(NO)和Y(NPQ)的影响Fig.2 Effects of Sigma Broad on Y(NO)and Y(NPQ)in leaves of foxtail millet

2.3 阔世玛对谷子幼苗叶片光合关键酶活性的影响

喷施阔世玛降低了张杂谷5 号的PEPC、NADPMDH 和PPDK 活性，而NAD-ME 和Rubisco 活性则随着阔世玛浓度的增加呈先升高后降低的趋势(图3)。2 个品种的PEPC 活性均在S1 时显著低于CK，NADPMDH 活性在S2 时显著降低。 张杂谷5 号的PPDK 活性在阔世玛浓度为15 mg·L-1(S2)时达到最小值，且在S1 时可以保持较高的活性；而晋谷21 号的PPDK活性在S1 时即显著降低。 2 个品种的NAD-ME 活性均在阔世玛浓度为15 mg·L-1(S2)时达到最大值，张杂谷5 号的S1、S2、S3 间差异不显著，且均与CK 差异显著；晋谷21 号S1 和S2 间差异不显著，但CK 和S1、S2 和S3、S3 和S4 间差异均显著。 张杂谷5 号的Rubisco 活性在阔世玛浓度为30 mg·L-1(S3)时达到最大值，S2 和S3 之间差异不显著；而晋谷21 号的Rubisco 活性在阔世玛浓度为7.5 mg·L-1(S1)时达到最大值，除CK 与S3 外，各处理间差异均显著。

2.4 阔世玛对谷子幼苗叶片糖含量的影响

2.4.1 阔世玛对谷子幼苗叶片还原糖含量的影响 谷子幼苗叶片还原糖含量随着阔世玛浓度的增加呈先上升后降低的趋势，且均在阔世玛浓度为15 mg·L-1(S2)时达到最大值，分别较CK 显著增加158.16%和133.69%(图4)。 张杂谷5 号喷施阔世玛各处理的还原糖含量均显著高于CK，晋谷21 号却只有S2、S3 的还原糖含量与CK 差异显著；2 个品种S2 和S3 间叶片还原糖含量差异均不显著。

图3 阔世玛对谷子幼苗叶片光合关键酶活性的影响Fig.3 Effects of Sigma Broad on the key enzyme activities of Photosynthetic enzymes in leaves of foxtail millet

图4 阔世玛对谷子幼苗叶片还原糖含量的影响Fig.4 Effects of Sigma Broad on reducing sugar content in leaves of foxtail millet

2.4.2 阔世玛对谷子幼苗叶片蔗糖含量的影响 由图5 可知，2 个品种喷施阔世玛处理的蔗糖含量均显著高于CK，且随着阔世玛浓度的增加呈先升高后降低的趋势，均在阔世玛浓度为15 mg·L-1(S2)时达到最大值，分别较CK 提高131.61%和194.33%。 但张杂谷5 号S1 和S2、S3 和S4 间差异均不显著，晋谷21 号S2 和S3 间差异不显著。

2.4.3 阔世玛对谷子幼苗叶片淀粉含量的影响 2个品种谷子幼苗叶片的淀粉含量均随着阔世玛浓度的增加呈先升高后降低的趋势，张杂谷5 号在阔世玛浓度为7.5 mg·L-1(S1)时达到最大值，较CK 增加11.54%；而晋谷21 号在阔世玛浓度为15 mg·L-1(S2)时达到最大值，较CK 增加26.09%(图6)。 张杂谷5号S3、S4 的淀粉含量差异不显著，但喷施各浓度阔世玛处理均与CK 差异显著；晋谷21 号S1 与CK 差异不显著，S2、S3、S4 均与CK 差异显著。

图5 阔世玛对谷子幼苗叶片蔗糖含量的影响Fig.5 Effects of Sigma Broad on sucrose content in leaves of foxtail millet

图6 阔世玛对谷子幼苗叶片淀粉含量的影响Fig.6 Effects of Sigma Broad on starch content in leaves of foxtail millet

2.5 阔世玛对谷子幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响

2 个品种谷子叶片的可溶性蛋白含量均随着阔世玛浓度的增加呈先升高后降低的趋势，均在阔世玛浓度为15 mg·L-1(S2)时达到最大值，且喷施阔世玛各处理均显著高于CK(图7)。 张杂谷5 号的S1、S2、S3、S4 分别较CK增加 75.72%、 97.77%、 53.16%、51.63%，S3 与S4 之间差异不显著。 晋谷21 号喷施阔世玛各处理分别较CK 显著增加25.85%、47.34%、32.40%和33.28%，且各处理之间差异均不显著。

图7 阔世玛对谷子幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响Fig.7 Effects of Sigma Broad on soluble protein content in leaves of foxtail millet

3 讨论

许大全[13]发现，导致光合作用降低的因素分气孔限制和非气孔限制两种，判断叶片光合速率降低的主要原因由Ci 和气孔限制值(stomatal limitation value，Ls)的变化方向决定，Ci 降低和Ls 升高表明气孔导度的降低是光合作用降低的主要原因；而Ci 升高和Ls降低则表明光合作用降低的主要原因是非气孔因素。本试验中，阔世玛浓度为7.5 mg·L-1时，谷子的Pn、Gs及Tr 均较CK 显著降低，而Ci 较CK 增加，导致叶肉细胞对CO2的同化能力降低[14]，说明是非气孔因素影响谷子叶片的Pn，叶片喷施阔世玛后光合作用过程受到一定程度的抑制，与原向阳等[15]和印志同等[16]的研究结果相似。

叶绿素荧光参数用于研究植物的光化学效率、光抑制与光破坏防御，在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有重要作用。Fo是光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ， PSⅡ)反应中心处于完全开放时的荧光产量，Fm是指PSⅡ反应中心完全关闭时的荧光产量，可反映通过PSⅡ的电子传递情况。 阔世玛胁迫下，谷子叶片在阔世玛浓度大于15 mg·L-1(S2)时Fo升高、Fm降低，说明光合系统(PSⅡ反应中心)遭到破坏[17]。Fv/Fm反映PSⅡ反应中心最大光能转换效率，植物受到胁迫时发生光抑制，该参数明显下降。 ETR 表示相对电子传递效率，反映光化学反应时碳固定的电子传递情况。 2 个品种谷子叶片的Fv/Fm和ETR 均随着阔世玛浓度的增加呈降低趋势，表明阔世玛处理使叶片受到光抑制，PSⅡ复合体受损害，电子传递效率降低，碳同化能量积累减少[18-19]。 Y(NPQ)是与光保护相关的所有热扩散，而Y(NO)是光损伤的重要指标。 随着阔世玛浓度增加，谷子叶片的Y(NPQ)升高，而Y(NO)降低，说明谷子受阔世玛胁迫后，吸收的光强相对过剩，通过增强热耗散来降低阔世玛胁迫造成的光损伤，减轻胁迫，从而保护光合系统[15]。

C4植物光合作用的4 个关键酶中，PEPC 能固定外界大气和植物呼吸所放出的CO2，捕获CO2作为CO2泵，提高光合效率[20-21]。 PPDK 主要催化CO2原初受体PEP 的再生，在NADP-MDH 的作用下进而生成苹果酸。 苹果酸进入到维管束鞘细胞中，在NADME 作用下释放的CO2被Rubisco 固定进入三羧酸循环，产生的丙酮酸进入叶肉细胞并被PPDK 重新利用[22-23]。 在C4种子发育过程中，PPDK 对淀粉合成、淀粉-蛋白间的平衡有协调作用，并能固定大气中低浓度的CO2，使之在亚适温弱光、干旱等逆境胁迫下呈现较高的光合效率。 本试验中，喷施阔世玛后降低了张杂谷5 号和晋谷21 号谷子幼苗叶片的PEPC、PPDK和NADP-MDH 活性，提高了Ci，而2 个品种的NADME 活性均随阔世玛浓度的增加呈先升高后降低的趋势，且均在阔世玛浓度为15 mg·L-1(S2)时达到最大值。 NAD-ME 的升高可能与谷子对阔世玛的防御有关[24]。 Rubisco 是存在于叶绿体基质中控制着植物光合碳代谢和光呼吸，催化核酮糖- 1，5 -二磷酸(ribulose-1，5-disphosphate， RuBP)的羧化和加氧反应，并调节二者之间关系的关键酶[25]。 本研究中，2个品种的Rubisco 活性也均随阔世玛浓度的增加呈先升高后降低的趋势，张杂谷5 号在阔世玛浓度为30 mg·L-1(S3)时达到最大值，而晋谷21 号在阔世玛浓度为7.5 mg·L-1(S1)时达到最大值。 高浓度下，Rubisco 活性下降的原因可能与其羧化酶被与氧气相关的加氧反应所破坏有关[25]。 Rubisco 活性的降低是引起光合速率下降的重要的非气孔因素之一，这与前人研究结果相一致[26]。

糖不仅是谷子光合作用固定碳源首先生成的产物，而且是谷子运输碳代谢产物和贮藏能量的主要形式，是谷子生长发育的基础。 叶片内光合产物的形成、运输、分配以及储存均是以各种碳水化合物的形式存在[27]。 随着阔世玛浓度的增加，张杂谷5 号和晋谷21号叶片中的淀粉、还原糖和蔗糖含量均呈先升高后降低的趋势。 较高水平的糖含量有利于维持植物糖酵解代谢[28]，蔗糖含量的降低则可能是谷子受到阔世玛胁迫的一种表现。 淀粉含量的多少是一个动态的平衡过程，与器官建成有关。 本研究中，在高浓度(≥30 mg·L-1) 阔世玛胁迫下，谷子叶片的淀粉含量显著降低，可能造成淀粉被分解。 15 mg·L-1阔世玛处理(S2)的晋谷21 号淀粉含量提高，可能是由于阔世玛影响了谷子叶片淀粉向蔗糖的转化，光合同化产物向根部运输、分配时受到抑制，导致光合作用下降，与前人研究结果一致[29-30]。 可溶性蛋白是植物体内重要的渗透调节物质，经常作为筛选植物抗逆性的重要指标。 在盐胁迫时，紫苏叶片的可溶性蛋白大量增加，说明此时紫苏叶片能够通过积累渗透调节物质平衡细胞与外界的渗透压，以保护细胞膜表面，从而抵御盐害[31]。 在阔世玛浓度为15 mg·L-1(S2)时，可溶性蛋白含量达到最大值，表明其参与了细胞生物膜及生命物质的保护，有利于谷子抵御逆境的伤害。

4 结论

叶面喷施浓度为15 mg·L-1的阔世玛对谷子会产生药害，显著抑制谷子叶片净光合速率，降低谷子叶片光系统反应中心的活性及光合作用过程中暗反应的关键酶PEPC、NADP-MDH 和PPDK 的活性，而且影响了Rubisco 和NAD-ME 的活性以及糖的代谢。 阔世玛在小麦田间得到了较好应用，却对谷子有抑制作用。 本研究在阔世码能够影响谷子生长发育的基础上进一步研究了阔世玛对谷子光合作用生理机制的影响，对谷子田间的化学除草和现代生产具有重要意义。