宋恭帅 张蒙娜 俞喜娜 王 杰 王宏海 薛 静 沈 清

(1浙江工商大学海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江 杭州 310012； 3海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心/大连工业大学，辽宁 大连 116034)

南美白对虾(Penaeus vannamei)是当今世界除罗氏沼虾与斑节对虾外第三大养殖虾类，其肉质鲜嫩、口感细腻，富含不饱和脂肪酸、蛋白质、矿物质和维生素等多种营养元素[1]。 其中，必需氨基酸含量高达38.80%，可弥补亚洲人因不良的饮食习惯造成的膳食结构不均衡。 研究表明，南美白对虾具有降血脂、降血压，促进儿童智力发育，预防动脉粥样硬化等生理功能[2-4]。 目前，南美白对虾的精深加工以蒸、煮、炸等热处理方式为主，不同加工方式对虾品质的影响也不一样。 随着生活节奏的加快，油炸方便速食食品深受广大消费者的喜爱[5]。 然而传统的油炸方式存在较多不足，如原料在油炸过程中色泽及营养价值损失较大，且含油量较高。 此外，油脂在高温条件下反复煎炸易发生裂变，产生大量醛、酮、酸等低分子次级分解产物，不利于身体健康[6-7]。 空气油炸作为一种新型、健康的油炸方式逐渐进入大众视野，其原理主要是利用热空气将原料包围，使空气中的油滴与原料直接均匀地接触，使原料逐渐脱水并产生油炸制品特有的形态。该方式在几乎不用油或用油量极少的条件下，就可得到与油炸口感类似的食品，避免将原料浸泡在热油中，有效降低了食品中的含油量[8]。 Ghaitaranpour 等[9]研究空气油炸和传统油炸方式对甜甜圈中含油量的影响发现，经空气油炸后甜甜圈中含油量较传统油炸方式降低了85.71%。 但不同的空气油炸温度易造成产品品质的不同，如高温条件下易造成多不饱和脂肪酸的氧化酸败而降低营养价值。 因此，测定不同空气油炸温度对样品脂质组成成分的影响是十分必要的。

快速蒸发离子化质谱(rapid evaporative ionization mass spectrometry， REIMS) 是一种新兴技术，使用iKnife 装置切入样品组织中，形成气溶胶，再由运输管道进入质谱仪电离源中，在激烈的碰撞表面发生离子化过程[10]。 该技术无需任何样品处理，仅需几秒就能完成数据采集和分析，规避了传统质谱技术用时较长的问题，且能对样品进行高通量实时监测。 目前，REIMS 已经成功应用于食品鉴别、肿瘤诊断等[11]。 如Song 等[12]通过iKnife-REIMS 联用技术检测分析三文鱼和虹鳟鱼的脂质组学轮廓差异，为科学评估市售三文鱼掺假情况提供了实时、准确的鉴别方法。

本研究以南美白对虾为原料进行空气油炸处理，通过iKnife-REIMS 联用技术实时测定经不同油炸温度处理的样品，对获取的脂质组学轮廓图谱进行结构鉴定和相对定量分析，并结合统计学分析，探究空气油炸温度对于南美白对虾脂质组成的影响，以期为进一步研究油炸过程对虾类脂质影响的机理和实践提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南美白对虾，购自杭州文一路物美大超市。

甲醇、乙腈、异丙醇均为色谱纯，德国Meker 公司；甲酸(色谱纯)，美国Tedia 公司；亮氨酸脑啡肽，美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

REIMS 系统:Xevo G2-XS 四极杆飞行时间质谱仪配有快速蒸发离子源，美国Waters 公司；Pump11 elite针泵注射进样器，美国Harvard 公司。 WSD151 iKinfe智能手术刀，德国Weller 公司；KL-J63A 空气炸锅，杭州九阳公司；Milliplus 2150 超纯水处理系统，美国Millipore 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理 将新鲜南美白对虾去头去壳后清理洗净，用滤纸擦拭表面水分，分别于140、170、200℃条件下空气油炸10 min，经自然冷却后待测。 在整个空气油炸过程中，并未在虾肉表面涂抹任何油脂。

1.3.2 REIMS 质谱条件 使用iKnife 智能手术刀切割南美白对虾，形成含有大量离子的气溶胶，经泵驱动，通过PTEE 管引入质谱仪中；以丙二醇/亮氨酸脑啡肽(m/z 554.261 5)混合物为辅助溶剂，经注射泵以0.1 mL·min-1的流速引入端口，用于清洗杂质、提高信号强度、锁定质量校正；质谱接口内设Kanthal A1 灯丝(1.1 Ω，3 V，500℃)用作辅助碰撞电离，离子碰撞后进入质谱仪StepWave 装置；质谱仪扫描时间:1 s；扫描范围:m/z 50～1 200；每个样品切割7 次以作重复，且每次切割停留3 s 左右；所有数据均以负电离模式收集。 iKnife 输出功率20 W， 辅助溶液流速100 μL·min-1，切割速度1 mm·s-1，切割长度约1 cm。

1.4 数据分析

将质谱图经MassLynx 4.1 进行峰匹配、滤噪、中心化和标准物质校准处理，结果保存为Excel 格式。根据质谱数据得到主要离子峰的质荷比和峰面积信息，结合Lipid MS Predictor 脂质分子数据库比对确定或推测脂质的结构信息。 采用峰面积归一化法计算所得脂质的相对含量。 平均值、标准差和显著性水平均采用SPSS 21.0 软件计算，显著性分析的置信区间为95%。 采用SIMCA 14.1 软件将磷脂数据进一步处理。

2 结果与分析

2.1 REIMS 脂质组学轮廓分析

在REIMS 操作系统中，单极电极为常用离子源，在给定电流下手持iKnife 切割组织，使表面小分子物质快速蒸发离子化，并通过PTFE 管进入质谱端口。通过对南美白对虾组织进行电切离子化，扫描范围m/z 50～1 200，同时以亮氨酸脑啡肽(m/z 554.261 5)为内标锁定质量并校准质量轴，通过MassLynx 记录质谱数据。 图1-A 是未经空气油炸南美白对虾在连续切割7 次后获得的总离子流图，其主要作用是为数据模型的建立提供充足的数据以及避免偶然事件的发生[13]。 图1-B 是在负离子模式下获得的未经空气油炸处理的南美白对虾质谱图。 在m/z 50 ～1 200 区域范围，不仅可以检测出脂肪酸、磷脂与甘油酯，也可检测出氨基酸等小分子物质[14]。 为了建立有效的数据统计模型，将检测区域缩小至m/z 200 ～1 000，被检测物以脂肪酸与磷脂为主，排除了小分子物质的烦扰。由图1-B 可知，脂肪酸离子峰簇位于m/z 200 ～500，而磷脂离子峰簇在m/z 600 ～900。 从相对强度来看，脂肪酸离子峰的信号响应明显强于磷脂离子峰的信号强度，前者的峰面积约为后者的2.4 倍。 脂肪酸离子一部分来源于胆固醇酯、磷脂、甘油酯等脂类受热高能裂解，另一部分由组织中少量游离脂肪酸电离生成，其脂肪酸链碎片化电离后反映在质谱图中[14]。 由图1-C可知，在正离子模式下南美白对虾中脂肪酸与磷脂并不能有效地被检测。 表明，南美白对虾中脂肪酸与磷脂只有在负离子模式下才能更有效地被检测。

2.2 不同空气油炸温度对南美白对虾脂质组成的影响

图1 未经空气油炸南美白对虾REIMS 全扫描总离子流图(A)与质谱图(B，C)Fig.1 REIMS total ion count chromatogram (A) and combined mass spectrum (B，C) in white shrimp without air frying

利用iKnife-REIMS 联用技术分别对未油炸和经140、170 及200℃油炸南美白对虾进行实时检测，获得相应的质谱图。 通过对质谱图进行降噪、去同位素等处理，筛选峰面积大于3.00E＋05 的离子峰，根据分子质量测定值推算其可能的化学结构。 由表1 可知，南美白对虾样品中共检出10 种主要的脂肪酸离子，根据偶氮规则，其在质谱图中质量数通常为奇数[15]。 在未油炸南美白对虾中，信号响应强度最大的脂肪酸为m/z 279，相对含量达到了21.88%，经鉴定其结构为FA 18:2，即亚油酸。 亚油酸是人体必需脂肪酸，具有抗粥状动脉硬化、增强肌体免疫、参与脂肪分解与新陈代谢、促进骨组织代谢等生理活性功能[16]。 其次分别为m/z 255(FA 16:0，19.10%)、m/z 281(FA 18:1，17.16%)、m/z 301(FA 20:5，16.59%)、m/z 327(FA 22:6，15.14%)等。 随着空气油炸温度的升高，各脂肪酸含量有显著性变化(P＜0.05)。 不饱和脂肪酸含量呈显著下降趋势，二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)与油酸(C18:1)含量变化较大，200℃空气油炸南美对虾较未油炸南美白对虾分别减少了9.29、9.63和9.40 个百分点。 这主要是由于高温促使不饱和脂肪酸发生了氧化或裂解[17]。 DHA 俗称“脑黄金”，EPA 被称为“血管清道夫”，分别对大脑发育和心血管健康具有重要的生理作用[18-19]。 随着油炸温度的升高，饱和脂肪酸含量呈显著上升趋势，其中，200℃空气油炸南美白对虾中的棕榈酸(C16:0)含量较未油炸增加了14.87 个百分点，这可能是由于空气油炸温度升高，更多的棕榈油酸(C16:1)转成了棕榈酸。 总之，南美白对虾样品中饱和脂肪酸含量随油炸温度的升高呈上升趋势，不饱和脂肪酸含量则相反；多不饱和脂肪酸较单不饱和脂肪酸更易被氧化，其含量减少更快。 这与宋恭帅等[20-21]研究的不同贮藏温度下鱼油单不饱和脂肪酸含量的变化趋势一致。

磷脂离子峰位于m/z 600 ～900 范围内，由于磷脂的信号响应明显低于脂肪酸，基质效应相对较强，经降噪和峰提取后，共检出31 种磷脂分子。 磷脂是生物体内重要的活性物质，具有降血脂、细胞识别、改善血液循环和提高人体免疫力等生理作用[22]。 根据极性头部基团的不同， 可以将磷脂分为甘油磷脂酸(phosphatidic acid， PA)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamines， PE)、 磷脂酰胆碱( phosphatidyl cholines， PC)和磷脂酰肌醇(phosphatidyl inositols，PI)等[23]。 未油炸南美白对虾中，信号最强的磷脂离子峰为m/z 744(20.16%)，其结构疑似为[PE 36:1-H]-，其次是m/z 764(15.92%)，结构为[PE 38:5-H]-/[PC O-36:5-H]-。 本试验中PE 和PC 分子检出最多，PI 次之，PA 最少。 这与水产品中PC 与PE分子较多的结论相一致[24]。 Balog 等[25]使用iKnife-REIMS 联用技术对牛肉、马肉等动物肌肉组织进行脂质轮廓分析，检出的脂质同样以PE、PC、PI 为主。 随着空气油炸温度的升高，不同处理虾样品间磷脂含量存在明显差异；随着油炸温度的升高，PE、PC 与PI 分子的相对含量总体呈减少趋势。 这可能是由于随着油炸温度的升高，组织中PC、PE 等分子极易丢失胆碱基团和氨基基团，最终生成[PA-H]-[15]。 该推论印证了结果中200℃油炸南美白对虾中PA 分子的相对含量显著增加(P＜0.05)，如m/z 725([PA 38:3-H]-)相对含量较未油炸样品增加了7.36 个百分点倍。 此外，随着油炸温度升高，磷脂分子的不饱和度逐渐下降，主要是由于高温油炸破坏了一部分的不饱和脂肪酸，使其发生氧化或加氢，提高了饱和度[23]。

2.3 多元回归分析

2.3.1 主成分分析 主成分分析( principal component analysis， PCA)，又称主变量分析，是一种简化数据集的数理统计方法。 通过线性变换，将一组可能存在相关性的变量转换成线性不相关的变量，并称转换后的变量为主成分[12]。 通过主成分得分图可以根据不同样品间的距离判别样品间的差异性[21]。

由图2-A 可知，64 个南美白对虾样品被分成有统计学意义的集群，即原料、140℃空气油炸、170℃空气油炸、200℃空气油炸，并分布于不同区域。 未油炸南美白对虾与其他3 个油炸样品明显地区分开，说明3种空气油炸温度对南美白对虾中脂肪酸与磷脂组成产生了影响。 根据REIMS 分析结果可知，140℃空气油炸对南美白对虾脂质组成影响最小，其在PCA 得分图上与未油炸南美白对虾距离最近。 经200℃空气油炸后的南美白对虾脂质变化最明显，与未油炸南美白对虾距离最远，说明差异最大，而170℃空气油炸后南美白对虾则处于二者之间。 PCA 得分图分析结果与REIMS 分析结果基本一致。 PCA 距离图(distance to the model， DModx)表示观测样本与主成分模型之间的距离，若距离过大，说明该样本对于模型的建立无有效贡献，一般DModx 值≤2.5[26]。 由图2-B 可知，本试验中64 个样品对于主成分模型的建立起到有效作用。 变量系数图(图2-C)主要表示41 种脂肪酸与磷脂的相对含量随油炸温度的变化情况，如m/z 770、m/z 277、m/z 281 等离子含量变化较为明显。 为了确定能区分4 组南美白对虾样品的重要离子，引用了变量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)。 当脂质离子的VIP 值≥1，则该离子为区别不同对虾样品的标记物[18]。 本试验共确定了24 个标记离子，即图2-C中带∗的离子。置换验证图(Permutation test)通过模型拟合度(R2)和预测能力(Q2)来评价该统计模型的有效性[27]。 由图2-D 可知，该模型的R2＝(0.0，0.014 8)，Q2＝(0.0，-0.173)，具有良好的可行性。

2.3.2 正交偏最小二乘判别分析 正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least-square discriminant analysis， OPLS-DA)是不同于PCA 的一种具有监督作用的判别分析统计方法，可以极大程度地解释观测值并有效实现对相应变量的预测。 OPLS-DA 可对两组经不同温度油炸的南美白对虾样品进行判别分析，并清晰展现两组样品间的差别[12]。 基于PCA 结果可知，未油炸样品与140℃空气油炸样品间的差异较小，而与170℃和200℃空气油炸样品的差异较大。 由图3-A、B 可知，140℃空气油炸样品与170℃及200℃空气油炸样品均有明显区别。 共享与特有化合物结构分析图(shared and unique structure-plot，SUS-plot)可以反映变量在2个OPLS-DA模型中变化趋势的异同[28]。在2 个模型中所特有的变量或者是变化趋势相反或一致的变量分别出现在SUS-plot平面坐标轴不同象限位置[29]。 由图3-C 可知，以140℃空气油炸样品为参比，对模型1(140℃vs 170℃)与模型2(140℃vs 200℃)进行SUS-plot 对比分析，分布在45℃斜线附近的变量离子在2 个模型中变化趋势相同；而分布在135℃斜线附近的变量离子则表示对2 个模型均有贡献，只是变化趋势相反。 图中m/z 818、m/z 844 及m/z 836 为170℃空气油炸样品特有离子；m/z 277、m/z 770 与m/z 810 为200℃空气油炸样品特有离子。 这6 种离子可用作鉴别170℃与200℃空气油炸样品的标记物。

表1 未油炸与不同空气油炸温度下南美白对虾中脂质组成及结构解析Table 1 The identity and content of lipids in white shrimp without air frying and processed under different air frying temperature

2.4 方法学验证

本试验选取m/z 255.232 6、m/z 279.232 8、m/z 744.554 7、m/z 764.524 7 为特征离子，以未油炸南美白对虾作为代表样品对REIMS 检测方法的灵敏度及精密度进行验证，其中精密度通过日内和日间精密度来衡量。 由表2 可知，目标脂质的信噪比范围介于38.1～99.7，表明方法灵敏度较高。 该方法日内精密度为4.1%～6.3%，日间精密度为6.2%～8.1%，表明此方法精密度和重复性较高。

2.5 实时鉴别

根据上述建立的iKnife-REIMS 联用技术对60 个经不同处理的南美白对虾样品进行随机鉴别，由图4可知，只有2 个盲样本被识别错误，即实时鉴别正确率高达96.67%，说明该方法具有良好的稳定性。 140℃空气油炸样品全部鉴别正确，170℃与200℃空气油炸样品各有一个鉴别错误。 这可能是由于170℃与200℃空气油炸对南美白对虾脂质组成影响差异不太明显，在实时鉴别过程中易发生错误。

3 讨论

油炸过程通常需要较高的温度。 食品在油炸过程中会发生一系列物理化学变化，如聚合、水解、氧化、裂变等[30]。 若油炸温度过高，食品中易产生少量的反式脂肪酸(trans fatty acid，TFA)。 研究表明，过多摄入TFA 对人体有极大的危害[31]。 选择合适的油炸温度是保证油炸食品品质的关键因素之一。 目前，关于油炸食品品质的评价主要以脂肪酸组成、酸价、过氧化值、共轭二烯、丙二醛等作为考核指标。 但这些传统的评价方法操作过程复杂，限制了其在食品科学领域的应用。 REIMS 技术通过手持iKnife 对组织样品表面离子化，无需任何样品前处理，就可实时获得质谱轮廓图。 经LiveID 等软件识别，并通过对特征离子峰降维、建模后，可有效实现对未知样品的实时鉴定与准确度评分。 目前，考虑到前端还未与高效液相色谱等分离技术联用，REIMS 相关研究主要以定性分析为主，其在有关化合物精确定量分析方面尚未有所建树。 故本研究主要在于获得相应南美白对虾的脂质组学轮廓图，对各脂质分子的绝对含量不做具体分析。

图3 正交偏最小二乘判别分析图Fig.3 Orthogonal partial least-square discriminant analysis plot

图4 REIMS 实时鉴别结果图Fig.4 The result of the correct classification rate of blind samples

表2 REIMS 南美白对虾脂质组学轮廓检测方法验证Table 2 The validation of REIMS method for lipidomics profiling of white shrimp

本研究从不同空气油炸温度处理的南美白对虾样品中检出的代谢物组成主要以脂质为主，即脂肪酸与磷脂。 在脂肪酸组成中未检测到TFA，说明在200℃空气油炸南美白对虾10 min 条件下不会产生TFA。磷脂分子中种类最多的是PC 与PE，这与之前报道中关于iKnife-REIMS 联用分析方法的研究结果相近[12]。对于除脂质外其他极性较大且稳定性较差的代谢物的检测，需要对组织样品的汽化蒸发能量进一步优化，包括降低切割能量，并提高方法的检测灵敏度等。 但切割能量的降低会减弱脂质化合物的汽化蒸发电离效率，不利于脂质组学研究。 因此，汽化蒸发电离能量或切割能量可直接决定检出的代谢物，是研究的重要影响因素之一。 今后的研究可以利用最新的离子淌度谱对不同迁移速率的离子进行快速分离后，再进行质谱分析检测，尽量避免质谱图中大量离子峰的重叠交叉。

此外，本研究还采用PCA 与OPLS-DA 进一步说明了不同油炸温度对南美白对虾脂质组成的影响，分析了不同样品间脂质含量变化的差异，最终确定了6个潜在标记离子用作鉴别不同样品。 最后，本研究对iKnife-REIMS 联用分析技术进行方法学验证，由于磷脂在生物组织中主要以细胞膜形式存在[22]，无法人为构建空白样品和梯度浓度标准样品体系，故在进行方法学验证时直接以信噪比为指标检测方法的灵敏度。结果证明了该方法的稳定性与可行性，为REIMS 技术的推广应用奠定了基础。

4 结论

本研究采用iKnife-REIMS 联用分析技术检测不同空气油炸温度下南美白对虾的脂质组成。 在负离子模式下，南美白对虾在iKnife 切割下激发成离子态生成气溶胶，通过PTFE 管引入质谱端口，经质量分析器共检出10 种脂肪酸和31 种磷脂分子。 随着空气油炸温度的升高，南美白对虾的脂肪酸与磷脂组成及相对含量均有显著变化。 采用PCA 可直接观察到不同油炸温度对与南美白对虾肌肉组织脂质组成有一定的影响；在此基础上进行OPLS-DA，通过SUS-plot 得到6个潜在标记离子可用于实时鉴别不同油炸样品。 该方法无需样品前处理，可实现空气油炸过程中南美白对虾脂质组学轮廓的实时检测，方法分析时间短，选择性、灵敏度、稳定性均较优，为脂质组学研究提供了新的技术手段。