李云峰，孙巍，周贺，李玉龙，鲍相渤

（1.辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁 大连 116023；2.大连海洋大学，辽宁 大连 116023）

海蜇Rhopilema esculentum 隶属于腔肠动物门，钵水母纲根口水母科海蜇属，是经济价值较高的大型食用水母，主要分布于中国、日本、朝鲜沿岸及前苏联远东沿岸[1]。海蜇味道鲜美、营养价值高、抗逆性强，已成为我国海水养殖的重要种类。目前，有关海蜇的研究主要集中在基础生物学[2-4]，营养及加工[5-7]、分子遗传学[8-10]、人工养殖技术[11-14]等，对其细胞遗传学研究很少。

染色体是细胞核中重要的组成部分，是生物发育、进化、遗传和变异的物质基础。染色体组型具有物种特异性和相对稳定性，能反映生物的遗传组成、遗传变异规律、发育机制、物种起源和进化历史。郭平[15]研究表明海蜇染色体数2n=42。由于海蜇染色体体积微小，呈短棒状，属于微小染色体，进行染色体的核型分析比较困难，因此尚无对其核型方面的研究报道。本研究利用空气干燥法制备海蜇的囊胚细胞染色体标本，采用Giemsa 和DAPI 两种染色方法，首次获得了较清晰的细胞有丝分裂中期的分裂相，并对其进行了数目统计及核型分析，旨在补充海蜇细胞遗传学和细胞生物学方面研究的不足，并为海蜇品种选育和遗传改良提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

海蜇取自营口现代渔业产业园，均为伞径（40±0.53）cm、体质量（5±0.47）kg 的性成熟个体。海蜇取回后暂养于辽宁省海洋水产科学研究院生物育种实验室的孵化池，暂养期间停止投喂饵料。当孵化池底部出现大量受精卵时，将受精卵收集于烧杯中，置于显微镜下观察，待海蜇胚胎发育至囊胚期收集于10mL 离心管中。

1.2 实验方法

1.2.1 染色体制备

（1）秋水仙素处理：将发育至囊胚期的胚胎细胞收集于10mL 管内，加入终浓度为0.4g/L 的秋水仙素（无菌海水配置）于24℃处理45min，反复吸打。

（2）低渗：将细胞悬液于1000r/min 离心10min，去除上清后加入0.075mol/L 的KCl 溶液，27℃低渗45min，轻轻吹打数次。

（3）固定：去上清后，加入-20℃冰箱中预冷的现配置的卡诺固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定3次，每次15min，后置于-20℃中过夜处理。

（4）解离：-20℃中取出已经固定好的细胞悬液于1000r/min 离心2min，去上清，加入预冷的50%冰醋酸1～2 滴进行解离后，加入-20℃预冷的新配置的卡诺固定液。

（5）滴片：将细胞悬液在距冰冻载玻片上1m 左右的高度滴下，酒精灯火焰干燥。

（6）染色：将载玻片置于现配置的10%Giemsa（pH=6.8）染缸内染色30min，用蒸馏水冲洗干净，或将载玻片用DAPI 染色，封片，染色24h，-20℃保存。

（7）观察，将染色体标本在显微镜下观察，在油镜下拍照。

1.2.2 染色体核型分析

选取60 个数目清楚，形态清晰的染色体中期分裂相进行染色体众数统计。选取5 个染色体数目完整且形态良好的中期分裂相，用Photoshop 软件进行染色测量和配对，分析核型。依据Levan 等[16]的分类标准对染色体进行分组和命名：臂比值为1.0～1.7 为中部着丝粒染色体（m），臂比值为1.7～3.0为亚中部着丝粒染色体（sm），臂比值为3.0～7.0 为亚端部着丝粒染色体（st），臂比值大于7.0 为端部着丝粒染色体（t）。

2 结果与分析

2.1 海蜇胚胎细胞染色体数目

实验选取60 个分散良好，形态清晰的海蜇囊胚期染色体中期分裂相计数染色体数目，由表1 可知染色体数目及所出现频率，其中染色体数目2n=42 出现52 次，占有丝分裂细胞总数的86.7%，由此认为海蜇染色体数目为2n=42。

表1 海蜇囊胚期染色体数目Tab.1 The number of chromosome in blastula stage of R.esculentum

2.2 染色体核型分析

表2 海蜇染色体组型数据Tab.2 Karyotypes of R.esculentum

实验选取海蜇胚胎细胞制备染色体标本，经Giemsa 和DAPI 染色后，在显微镜下观察到了清晰的有丝分裂中期分裂相。海蜇囊胚期有丝分裂中期的染色体形状为短棒状（图1），由染色体相对长度（相对长度=每条染色体长度/单倍染色体长度×100）和臂比值可知，海蜇染色体组成为中部着丝粒染色体（m）10 条，亚中部着丝粒染色体（sm）14 条，亚端部着丝粒染色体（st）12 条，端部着丝粒染色体（t）6 条（表2），海蜇染色体核型公式为2n=42=10m+14sm+12st+6t，NF=78。

3 讨论

目前，制备腔肠动物染色体所用组织，主要有胚胎[17]、螅状体、碟状体[15]、触手[18]及整体浸泡[19]等。本研究采用海蜇发育至囊胚期的胚胎细胞做为实验材料，因其具有细胞大，有较高的有丝分裂指数，且实验重复性好的特点，因此制片中了获得大量清晰的细胞分裂中期分裂相。关于海蜇染色体核型的研究很少，早期研究者[15]只报道了海蜇染色体数目，未提供核型公式。本研究除采用Giemsa 染色方法以外，还采用DAPI 染色制备海蜇染色体图谱。DAPI 是一种特异性强，灵敏度高的荧光染料，其与DNA 形成的复合物能发出稳定的浅蓝色荧光，便于显微照相观察[20,21]。将图1 中a、b 及已报道的图片相比较可以发现相比于Giemsa 不容易上色，DAPI染色方法使染色体轮廓更为明显，更有利于染色体的核型分析，为海蜇等染色体形态小、着丝点位置不明显的种类的染色体数目确定及染色体定位等细胞学研究奠定了技术基础[22]。

本实验选取60 个分散良好、形态清晰的海蜇囊胚期染色体中期分裂相计数染色体数目，研究确定了海蜇染色体数目为2n=42，染色体呈短棒状，这一数目与郭平[15]的研究结果相同，而少于海月水母Aurelia aurita[18]2n=44，多于水螅纲的厦门隔膜水母Leuckartiara hoepplii Hsu 2n=30[19]。有研究表明[22,23]染色体的数目可以作为物种进化过程中亲缘关系判定的依据，本研究总结出相对准确的海蜇核型公式为2n=10m+14sm+12st+6t，NF=78，染色体大小差别不明显，这与海月水母Aurelia aurita 2n=44m，NF=88 及国外学者[24,25]报道的水螅Pelmatohydra oligactis 和P.baikalensis，2n=30，NF=56，且染色体大多为中部和亚中部着丝粒染色体的结果有很大差别。有研究[26]指出在分类阶元中，具有较多端部着丝粒染色体的是原始类群，而具有较多中部或亚中部着丝粒染色体的是特化类群，这一观点证明了海蜇在腔肠动物中是原始类群。

本研究获得了海蜇染色体的准确数目及核型，此结果将为染色体操作育种、杂交育种等育种方法在海蜇遗传改良方面提供依据，并为海蜇染色体基因定位、细胞遗传学等遗传基础研究奠定基础。