王庆旭

(濮阳市油田总医院放疗科，河南 濮阳 457000)

结肠癌是一种十分常见的消化道肿瘤之一，每年导致近70万人死亡[1]。据统计，结直肠癌在近几十年来的诊断和治疗中虽然有所改善，但是仍然有25%到30%的患者因未能及时做出诊断而错过了手术切除的最佳机会，有近30%到50%的患者在手术切除后有复发和转移的情况[2]。因此，寻找新的调控结直肠癌发生的分子机制对于结直肠癌的诊断和靶向治疗具有重要的意义。

miRNA是一种小的非编码RNA分子，可以通过与靶基因mRNA的互补结合来调节mRNA的翻译，来阻断蛋白质的表达，或导致mRNA的降解[3]。有大量的研究表明，miRNAs在基因表达调控中起着重要作用，miRNAs在不同的肿瘤中的表达情况不同，这引起了人们的广泛关注[4]。miR-141-3p是一类保守性的miRNAs，在不同癌症中均有异常表达。例如，在前列腺癌中miR-141-3p通过抑制KLF-9的表达促进前列腺癌细胞的增殖[5]。miR-141-3p通过靶向p53促进胶质母细胞瘤的进展和耐药性[6]。此外还有研究表明miR-141-3p在乳腺癌[7]和胃癌等中也发挥作用。但miR-141-3p在结肠癌中的机制和功能少有研究。

UNC5C是一种新的受体，属于UNC5H功能依赖性受体家族，具有诱导细胞凋亡的能力[8]。在近几十年的研究中，UNC5C不仅在调控细胞的迁移、血管网络的建成和组织发育中发挥着重要作用，还参与了肿瘤发生及肿瘤的转移等过程[9]。UNC5C在正常组织中广泛表达，但在多种肿瘤组织中表达下调。例如，在人肾癌细胞[10]和前列腺癌细胞[11]中，UNC5C均出现明显表达下调。目前，UNC5C在结肠癌组织中表达情况研究较少。

本研究通过探究miR-141-3p和UNC5C对结肠癌细胞的生物学功能的影响，为结肠癌靶向治疗提供新的潜在靶点和理论依据。

1 材料与方法

1.1 生信分析

从TCGA数据库下载TCGA-COAD的miRNA成熟体表达数据和mRNA的测序数据，利用edgeR来鉴定差异基因(|logFC|>2，padj<0.05)，结合样本的临床信息对差异miRNA进行生存分析。确定miRNA之后，利用targetScan、miRDB数据库对目标miRNA进行靶向预测，并与差异mRNA取交集，获得与目标miRNA具有靶向结合位点的差异mRNA。

1.2 细胞培养

人正常结肠上皮细胞系FHC(BNCC338003)以及人结肠癌细胞系HCT-116(BNCC337692)、SW620(BNCC337664)、SW480(BNCC100604)、HT-29(BNCC337732)均购自北纳生物。将所有细胞系在含有10%FBS的DMEM完全培养液(Gibco，Carlsbad，CA，UnitedStates)中培养，且放置于37°C下5%CO2的加湿培养箱中。

1.3 细胞转染

miR-141-3pmimics，miR-141-3pinhibitor及其阴性对照，购自RiboBioCo.，Ltd.(中国，广州)。UNC5C过表达质粒(oeUNC5C)及其阴性对照(vector)购自RiboBio。根据制造商的方案，用Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行细胞转染。温育48 h后，收获细胞，然后进行实验。

1.4 实时荧光定量PCR检测

通过TRIzol试剂(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)从组织细胞中提取总RNA，然后用紫外分光光度计(BD，Franklin Lakes，NJ，United States)测定RNA浓度和纯度。使用qScript micro RNA cDNA合成试剂盒(Quantabio，Beverly，MA)将miRNA反转录为cDNA。使用cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)将mRNA反转录为cDNA。使用ABI Steponeplus Real-time PCR system(Applied Biosystems，Foster City，CA，United States)进行定量PCR试验，实验流程为95℃ 3min，95℃ 10 s和59℃ 20 s循环40次。其中UNC5C以GAPDH作为内参，miR-141-3 p以U6为内参。引物序列如下：miR-141-3pforward：5′-CGCAGTAACACTGTCTGGT-3′；reverse：5′-GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCCATCT-3′；U6forward：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′；reverse：5′-CGGCTGCAGATGAGATAG-3′；UNC5Cforward：5′-GCAAATTGCTGGCTAAATATCAGGAA-3′；reverse：5′-GCTCCACTGTGTTCAGGCTAAATCTT-3′；GAPDHforward：5′-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCAT-3′；reverse：5′-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′。结果用2-ΔΔCt值来比较对照组和实验组的目的基因mRNA相对表达量的差异，实验重复3次。

1.5 Western blot实验

用RIPA裂解缓冲液(Beyotime，China)提取细胞裂解产物，采用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime，China)测定蛋白浓度。高温变性后进行SDS-PAGE。电泳结束后，以150 mA、120 min将蛋白转移至PVDF膜，并用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗，4℃过夜孵育。其中一抗为：UNC5C(ab178823，1∶100，Abcam，China)以及GAPDH(ab9485，1∶2500，Abcam，China)。TBST洗膜3次，每次5 min。然后与二抗山羊抗兔IgG(ab6721，1∶5000，Abcam，China)在室温下摇床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min。最后使用化学发光试剂盒(Millipore，Burlington，MA，UnitedStates)检测蛋白质信号。

1.6 细胞增殖实验

采用MTT实验检测细胞增殖。将结肠癌细胞以每孔10000个接种到96孔板，每孔体积200 μL。分别培养1 d，2 d和3 d后，每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，继续在37℃下孵育4 h，然后每孔加入100 μL DMSO在37℃下孵育过夜。利用酶联免疫监测仪(Vircell，Spain)，在490 nm波长下测定各孔光吸收值。各组实验均重复三次。

1.7 细胞划痕实验

细胞在培养孔中丰度达到80%时，使用200 μL移液管尖端轻轻刮擦穿过孔中心的单层。将孔用培养基短暂洗涤两次以除去分离的细胞。加入新鲜培养基，细胞再生长24 h，后用显微镜观察划痕并拍照以分析细胞迁移情况。

1.8 细胞侵袭实验

采用24孔Transwell室(8μm孔径，BDBiosciences，USA)进行Transwell侵袭测定。4℃条件下将Matrigel胶稀释后，取100 μL均匀铺于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置1 h。分别将各处理组细胞的浓度调整至5×104个细胞/mL悬液接种于Transwell的上室内，下室加600～800μL含10%胎牛血清的培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，取出小室，棉签擦去微孔膜上室的细胞，PBS冲洗小室上下面2遍，1%的结晶紫染色15 min，PBS冲洗小室，干燥后置于100倍的倒置显微镜下观察。

1.9 双荧光素酶实验

将表达载体pmirGLO构建野生型(WT)或突变型(Mut)3′UTRUNC5C结构。将两种报告质粒、过表达质粒miR-141-3pmimics以及NCmimics分别共转染至结肠癌HCT-116和SW480细胞中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System，E1910，Promega)检测荧光素酶活性。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火荧光素酶，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。

1.10 统计学方法

对数据进行处理，采用SPSS 22(IBM，SPSS，Chicago，IL，USA)系统，计量资料采用均值±标准差的形式表示，两组间比较为t检验，多组间的比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有显著性统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌细胞中miR-141-3p高表达

通过edgeR进行差异分析，共获取299个差异miRNA(见图1A)。其中miR-141-3p在结肠癌组织中显著上调(见图1B)，且生存分析结果显示，结肠癌组织中miR-141-3p高表达患者的生存时间显著低于低表达患者(见图1C)。然后利用qRT-PCR检测结肠癌细胞HCT-116、SW620、SW480、HT-29细胞系以及人正常结肠上皮细胞系FHC中miR-141-3p的表达，结果如图1D。结果表明，与人正常结肠上皮细胞相比，结肠癌细胞系中miR-141-3p的表达水平显著上调。之后，我们选择结直肠癌细胞系HCT-116和SW480进行后续的功能实验。

2.2 下调miR-141-3p抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

为了评估miR-141-3p在结肠癌细胞系(HCT-116和SW480)中的生物学功能，将miR-141-3pinhibitor和miR-141-3p-NCinhibitor转染入HCT-116和SW480结肠癌细胞系中。利用qRT-PCR检测各组细胞系中miR-141-3p的表达，结果表明，转染miR-141-3pinhibitor后结肠癌细胞中的miR-141-3p表达量显著降低(见图2A)。然后通过MTT实验来检测各组细胞的增值能力，发现下调miR-141-3p明显抑制了结肠癌细胞的增殖能力(见图2B)。细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力，结果显示下调miR-141-3p后结肠癌细胞迁移能力明显低于对照组(见图2C)。最后通过Transwell实验分析各组细胞的侵袭能力，结果表明下调miR-141-3p明显抑制了结肠癌细胞的侵袭能力(见图2D)。以上实验表明，下调miR-141-3p会抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

2.3 结肠癌细胞中miR-141-3p靶向结合UNC5C

之后，我们对miR-141-3p的下游调控机制进行了研究。为进一步分析miR-141-3p的靶基因，通过edgeR进行差异分析，共获得2065个差异mRNA(见图3A)。利用TargetScan、miRDB两个数据库对miR-141-3p进行靶基因预测，并与下调的903个差异mRNA取交集，获得38个与miR-141-3p具有靶向结合位点的靶基因(见图3B)，并且对它们进行表达分析发现，UNC5C在结肠癌细胞中呈现极显著的低表达(见图3C)。相关性分析显示，miR-141-3p与UNC5C具有显著的负相关性(见图3D)。之后，利用qRT-PCR检测结肠癌细胞HCT-116、SW620、SW480、HT-29以及人正常结肠上皮细胞系FHC中UNC5C的表达，结果如(见图3E)。研究发现与人正常结肠上皮细胞相比，结肠癌细胞系中UNC5C显著低表达。然后利用WB检测各细胞系中UNC5C的蛋白表达，结果显示在结肠癌细胞系中UNC5C的蛋白表达水平明显下调(见图3F)。

图1 结肠癌细胞中miR-141-3p高表达

注：A：TCGA数据库结肠癌的normal组和tumor组的差异miRNA火山图；B：miR-141-3p在normal组和tumor组的表达量箱线图，其中浅色表示正常组织，深色表示结肠癌组织；C：miR-141-3p的表达量对患者预后的生存曲线，黑色线表示高表达组，灰色线表示低表达组；D：qRT-PCR检测结肠癌细胞HCT-116、SW620、SW480、HT-29细胞系以及人正常结肠上皮细胞系FHC中miR-141-3p的表达量；*表示P<0.05。

注：A：qRT-PCR检测各组细胞系中miR-141-3p的表达；B：MTT实验来检测各组细胞的增值能力；C：细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力；D：Transwell实验分析各组细胞的侵袭能力；*表示P<0.05。

注：A：TCGA数据库结肠癌的normal组和tumor组的差异mRNA火山图；B：miR-141-3p预测的靶基因和差异mRNA的venny图；C：UNC5C在normal组和tumor组的表达量箱线图，其中浅色表示正常组织，深色表示结肠癌组织；D：miR-141-3p与UNC5C的相关性分析；E：qRT-PCR检测结肠癌细胞HCT-116、SW620、SW480、HT-29细胞系以及人正常结肠上皮细胞系FHC中UNC5CmRNA的表达；F：WB检测各细胞系中UNC5C的蛋白表达；*表示P<0.05。

为了探究miR-141-3p与UNC5C的结合关系，首先通过miRNA数据分析软件(starBase)寻找UNC5C与miR-141-3p的结合位点，结果显示UNC5C与miR-141-3p存在结合位点(见图4A)。利用双荧光素酶实验来检测miR-141-3p和UNC5C的靶向关系，结果表明，上调miR-141-3p会抑制UNC5C-wt的荧光素酶活性，而对UNC5C-mut没有影响(见图4B)。然后利用qRT-PCR检测结肠癌细胞中转染miR-141-3pmimics或miR-NC后UNC5C的mRNA表达水平，结果发现过表达miR-141-3p可以显著下调UNC5C的mRNA表达水平(见图4C)。通过WB检测不同组结肠癌细胞中UNC5C的蛋白表达水平，结果表明，过表达miR-141-3p可以显著下调UNC5C的蛋白表达水平(见图4D)。以上实验表明在结肠癌细胞中miR-141-3p能靶向结合UNC5C并且抑制UNC5C的表达。

2.4 miR-141-3p通过靶向UNC5C促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

为了验证miR-141-3p是否可以通过靶向UNC5C促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，我们通过过表达结肠癌细胞HCT-116和SW480中的miR-141-3p和UNC5C来进行分析。首先，通过qRT-PCR检测各组细胞的UNC5CmRNA表达水平，结果表明过表达miR-141-3p可以抑制UNC5CmRNA表达，但是同时过表达UNC5C会减弱过表达miR-141-3p对UNC5CmRNA表达的抑制效果，与对照组无显著差异(见图5A)。利用WB检测各细胞组的UNC5C蛋白水平，结果显示过表达miR-141-3p后UNC5C的蛋白表达水平显著下调，但是同时过表达UNC5C后UNC5C蛋白表达水平与对照组无显著差异(见图5B)。之后，利用MTT实验检测各组细胞增殖的情况，结果表明，过表达miR-141-3p可以促进细胞的增殖，但是同时过表达UNC5C会下调过表达miR-141-3p对细胞增殖的促进效果(见图5C)。利用细胞划痕实验分析各组细胞的迁移能力，发现过表达miR-141-3p可以促进细胞的迁移能力，但同时过表达UNC5C会使过表达miR-141-3p对细胞迁移能力的促进效果减弱(见图5D)。同样，利用Transwell实验分析各组细胞的侵袭能力，结果显示过表达miR-141-3p可以增强细胞的侵袭能力，但同时过表达UNC5C后细胞侵袭能力与对照无显著差异(见图4E)。通过以上分析，我们发现miR-141-3p可能通过靶向UNC5C促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

图4 结肠癌细胞中miR-141-3p靶向结合UNC5C

注：A：生信分析miR-141-5p和UNC5C的靶向结合位点；B：双荧光素酶实验来检测miR-141-5p和UNC5C两者的靶向关系；C：qRT-PCR检测结肠癌细胞中转染miR-141-3pmimics或NCmimics后UNC5C的mRNA表达水平；D：WB检测结肠癌细胞转染miR-141-3pmimics或NCmimics后UNC5C的蛋白表达水平；*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3 讨论

先前的研究已证明，miR-141-3p在多种癌症类型中均具有致癌活性，例如卵巢癌[12]和三阴性乳腺癌[13]。临床证据表明，在结肠癌中，miR-141-3p过表达与不良预后之间存在显着关联[14]。在神经胶质瘤中，发现miR-141-3p抑制细胞增殖并促进细胞凋亡[15]。Li，等[16]发现宫颈癌中miR-141-3p的表达明显高于正常宫颈组织，miR-141-3p的表达水平与肿瘤大小以及淋巴结转移状态有关，并且miR-141-3p的过表达显著促进宫颈癌细胞的增殖、集落形成、侵袭以及上皮向间质的转化。本研究中，我们发现在结肠癌细胞中miR-141-3p显著高表达，并且下调miR-141-3p会抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。该研究表明在结肠癌中miR-141-3p有致癌因子的作用，与之前的研究一致。

通过生信分析发现UNC5C可能是miR-141-3p的靶基因，并且通过分子实验对UNC5C进行表达分析发现UNC5C在结肠癌细胞中显著下调。近年来神经生长因子Netrin-1受体UNC5C作为大肠癌中可能的抑癌基因被广泛研究[17]。Thiebault，等[18]人研究了人类UNC5A、UNC5B或UNC5C在包括子宫癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、肺癌或肾癌在内的多种癌症中的表达情况，研究表明其在癌症中表达下调。此外，专门针对UNC5C的最新研究表明，UNC5C在大肠癌和胃癌中显著低表达[19-20]。这与我们的研究结果相一致。此外，双荧光素酶实验表明miR-141-3p对UNC5C具有靶向调控作用。功能分析实验进一步证明miR-141-3p可以通过负调控UNC5C促进肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，本实验证明了在结肠癌中miR-141-3p对UNC5C有靶向调控作用，并且影响结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学功能。这一结果使人们更为深入地了解了miR-141-3p在结肠癌中所起的作用，为结肠癌的靶向治疗提供了新的途径。

注：A：qRT-PCR检测各组细胞的UNC5CmRNA表达水平；B：WB检测各细胞组的UNC5C蛋白水平；C：MTT实验检测各组细胞增殖的情况；D：细胞划痕实验分析各组细胞的迁移能力；E：Transwell实验分析各组细胞的侵袭能力；*表示P<0.05，**表示P<0.01。