杨慧菊　兰玉倩　王石华

摘要：低温是限制植物生长和分布的主要逆境因子之一。植物遭受低温胁迫时会迅速启动相关基因，进行转录调控，合成相应蛋白质，进而控制代谢物的合成。为了抵御和适应低温环境，植物形成了复杂的调控网络。随着现代分子生物学迅速发展，组学已经成为植物响应逆境胁迫机理研究的重要方法，如基因组、转录组、蛋白质组和代谢组。这些组学研究技术相结合，能够为探究植物响应低温胁迫的基因调控网络提供有力手段。本文综述转录组、蛋白质组与代谢组等组学技术用于分析植物应答低温胁迫的研究进展，以期为揭示植物耐寒机理及优良耐寒植物的筛选与培育提供参考。

关键词：低温胁迫;转录组学;蛋白质组学;代谢组学

中图分类号：S184：Q945.78文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）05-0142-07

Abstract Low temperature is one of the major stress factors affecting growth and distribution of plants. The expression of related gene would be activated rapidly for transcriptional regulation，and then the corresponding proteins could be synthesized to control metabolite synthesis when plants under low temperature stress. The plants have formed a complex regulatory network to resist and adapt to the low temperature environment. With the rapid development of molecular biology， omics， including genomics， transcriptomics， proteomics and metabolomics have become the frequently used approaches to study the response mechanisms to stress in plants. The combination of these omics could provide powerful tools for gene regulation network exploration of plants in response to low temperature stress. In this paper， we mainly summarized the methods and application of transcriptomics， proteomics and metabolomics under low temperature， which would be helpful for understanding mechanisms of plant cold tolerance.

Keywords Low temperature stress; Transcriptomics; Proteomics; Metabolomics

温度是植物生长发育过程中的重要环境因子之一，只有在适宜温度条件下植物体才能正常进行物质运输和能量交换。低温不仅会限制植物生长发育，还会影响其种类分布;农业生产中，低温会严重影响农作物的品质和产量。近几年，气温变化异常，极端天气频繁出现，低温冻害也日趋严重。低温已成为限制植物栽培和农业生产较为严峻的问题之一[1，2]。通过了解植物响应低温胁迫的机制，挖掘抗寒基因，再应用基因工程改良植物抗寒性，进而减少低温对植物造成的损伤。

植物响应低温胁迫是一个复杂的生理过程，涉及到基因水平、转录水平、蛋白水平和代谢水平。随着组学技术的迅速发展，包括轉录组学、蛋白质组学和代谢组学等，已被广泛应用到植物响应逆境胁迫相关研究中，为抗逆基因鉴定及标志性代谢物的挖掘提供了有力手段。近几年，综合多组学数据系统全面地解析生物分子功能和调控机制已成为研究的热点[3]。因此，本文对近年来植物响应低温胁迫的组学研究进展进行综述，以期为植物应答低温胁迫研究的未来发展提供参考。

1 转录组学研究

转录组学（transcriptomics）是一门从 RNA 水平研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科，通过对某一特定生理条件下植物体内全部转录本的 RNA 序列进行测序，揭示逆境胁迫下整个基因组水平的表达情况，是进行基因功能研究的一个重要手段。转录组学研究技术主要包括两大类：基于杂交技术的cDNA芯片技术、寡聚核苷酸芯片技术和基于测序技术的表达序列标签技术（EST）、基因表达系列分析技术（SAGE）、大规模平行测序技术（MPSS）、RNA测序技术（RNA-Seq）。其中基于杂交的芯片技术，对低丰度基因及无参考基因组植物的研究存在限制问题，且灵敏度较低。随着高通量测序技术的快速发展，基于测序的RNA-Seq技术具有高通量、高灵敏度、高分辨率等特点，已被广泛应用于植物转录组学研究中[4，5]。

转录组水平的研究，是反映植物在某一特定生长发育阶段或生理条件下细胞、组织或器官所有基因的表达情况，具有一定的动态性，能够更加全面地揭示植物在低温胁迫下基因的转录情况及调控关系。转录组学研究技术已应用于多种植物响应逆境胁迫的研究中，包括干旱、盐、金属、温度等非生物胁迫和病原菌、病虫害等生物胁迫[6]。目前，已利用基因芯片技术对拟南芥和水稻等模式植物在非生物胁迫下的基因表达情况进行了分析[7，8];运用RNA-Seq技术已在全基因组水平上对玉米苗期响应盐、干旱、高温和低温逆境的分子机制进行了研究，共鉴定到5 530个差异表达基因，它们主要与激素代谢、信号调节、转录因子、脂肪酸的生物合成以及脂质信号转导有关[9]。

近几年，随着高通量测序技术的快速发展，转录组学已被广泛应用到果树、大田作物、林木、蔬菜等响应低温胁迫的相关研究中。如：利用高通量测序技术进行野生蕉低温响应的全转录组学分析，发现miR359、miR408、miR172等會特异响应寒害和冻害胁迫，表明这些miRNAs很可能在野生蕉响应低温胁迫过程中起着重要作用;差异表达lncRNAs靶基因显著富集于糖酵解、可变剪接体、碳代谢和生物素代谢途径中[10]。对3℃低温处理12 h的枇杷幼果进行转录组测序，发现枇杷响应低温胁迫过程中有多个参与调控油菜素甾醇生物合成和磷脂酸肌醇信号系统的差异基因上调表达，表明油菜素甾醇生物合成和磷脂酰肌醇信号系统在枇杷低温抗性中发挥重要作用[11]。火龙果实生苗在-2℃胁迫下进行转录组测序，发现低温诱导表达的基因多于低温抑制的基因数目，且这些诱导表达的基因主要存在于光合作用通路和代谢通路中，表明低温胁迫可能对火龙果的光合作用以及物质代谢产生了较大影响[12]。

在农作物响应逆境胁迫的研究中，对低温和常温处理的两个甘蔗品种进行转录组测序，发现两个品种的共有差异表达基因显著富集于逆境反应、膜系统、光合作用;品种间的差异表现为，抗寒性较强的品种其叶绿体膜结构相对稳定、光合能力较高，其细胞膜稳定性也有差异，因此两个甘蔗品种的差异表达基因分别富集于不同的通路，即桂糖 08-1180在 DNA 整合、RNA 聚合酶、ADP 结合及代谢酶中富集较多，而ROC22显著富集在有机化合物的合成、运输和转运蛋白活性[13]。孟玉等[14]也对4℃低温胁迫不同时长后的蔗茅野生种进行差异基因表达谱分析，发现两个不同处理时间下的样本，差异表达基因共同富集于植物激素信号转导、植物-病原体互作、光合作用、淀粉和蔗糖代谢以及苯丙烷生物合成等途径中。利用 RNA-Seq 技术，对4℃低温驯化28天和-5℃低温处理24 h后的小麦幼苗茎基部基因表达进行分析，发现多个与转录因子、钙信号转导和冷诱导蛋白相关的共有差异基因，这些基因主要参与植物激素信号转导、淀粉和糖代谢以及次级代谢物合成等途径[15]。为了明确低温应答对水稻苗期生长发育的调节机制，对17℃低温处理下的粳稻品种中花-11进行转录组测序，主要分析了光合作用通路和苯丙氨酸代谢通路中差异基因表达情况及新基因功能预测，发现低温主要影响其光合作用、次生代谢的生物合成以及苯丙氨酸代谢;新基因预测中发现了2个转录因子WRKY115和WRKY117，表明水稻幼苗响应低温过程中发生了显著变化[16]。将不同抗冻性的玉米自交系在-1℃培养箱中分别进行1、3 h和5 h的低温处理，之后进行转录组测序，发现抗冻自交系和冻害敏感自交系中存在4 550个基因在4个不同处理中差异性表达，其中有360个基因在抗冻自交系中特异性表达;这些特异性表达的基因主要参与了低温响应、有机酸转运等;此外，泛素连接酶复合体也显著富集[17]。李萌[18]也对4℃低温处理0、4、24 h的抗低温自交系M54和不抗低温自交系753F叶片进行了高通量转录组测序，发现M54和753F中各有3 970个和1 766个基因呈现差异表达;通过KEGG注释，发现与抗低温相关的苯丙烷途径、苯丙氨酸代谢途径、淀粉和糖代谢途径、碳代谢途径等通路在两个自交系中均呈现差异表达基因富集，表明次生物质代谢及碳水化物代谢在玉米抗低温过程中发挥重要作用。利用数字基因表达谱技术，对-2℃低温胁迫处理后的马铃薯进行差异基因表达谱分析，发现受低温胁迫诱导差异表达的基因主要参与信号生物代谢、氧化还原、能量代谢、次生代谢等过程[19]。

近年来有关木本植物响应低温胁迫的转录组学研究也取得较快进展。Chen等[20]采用Solexa 测序技术完成了胡杨苗木响应低温的转录组测序，发现差异表达基因主要富集于转录因子和与ABA、钙信号传导相关的关键转录成分;对弯刺蔷薇低温驯化响应的转录组进行测序，发现枝条中差异表达和差异上调表达基因均多于叶片，但其差异表达基因的KEGG 代谢通路均富集于植物激素信号传导、淀粉和蔗糖代谢和植物病原菌互作上[21]。

此外，转录组学也广泛运用于蔬菜作物响应低温的研究中。对4℃低温胁迫0、2、6、12 h和24 h的甘蓝型油菜叶片进行转录组分析，发现大量与生物调控、免疫过程、代谢过程和应激响应等相关的差异功能基因，这些基因多数显著富集在植物昼夜节律、植物-病原菌互作、植物激素信号转导及次生代谢物生物合成等通路中[22]。利用TOM2芯片分析了4℃低温胁迫3 d的抗/感番茄幼苗基因表达差异，发现与光合作用相关的基因在抗感材料中均被抑制，且茉莉酸生物合成、油菜素内酯代谢过程、苯丙素生物合成、淀粉降解等代谢途径在抗感材料间均发生显著变化[23]。采用RNA-Seq技术对独行菜低温萌发停滞前后的种子进行转录组分析，共获得2 108个差异表达基因，它们主要富集在转录调控、核糖代谢、萜类化合物合成和植物激素信号转导等过程[24]。

由于植物对低温的耐受性不同、低温胁迫程度不同，植物体会表现出不同的响应。通过对低温下植物转录水平进行分析，能够得到许多植物响应低温胁迫相关的差异表达基因。通过对这些差异基因进行注释和功能分类，发现它们主要参与一些信号转导、光合作用、物质合成和代谢途径。这些差异基因的表达模式，为抗寒性基因功能研究提供了许多候选基因，也为进一步研究植物抗寒性分子机制以及抗寒品种选育奠定基础。

2 蛋白质组学研究

蛋白质是构成细胞的基本物质，是生命活动的主要承担者。蛋白质组（proteome）是指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全套蛋白质。蛋白质组学（proteomics）是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学，包括对蛋白质表达模式的研究和蛋白质组功能模式的研究，主要涉及蛋白质的分离、鉴定和生物信息学分析等技术。蛋白质分离技术主要包括双向凝胶电泳（two-dimensional gelelectrophoresis，2-DE）、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛细管电泳技术（capillary electrophoresis，CE）;蛋白质组学鉴定主要有质谱技术（mass-spectrometric technique）和多维蛋白质鉴定技术（multidimensional protein identification technology，MudPIT）;蛋白质生物信息学分析主要有免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）、酵母双杂交（yeast two-hybrid）、蛋白质芯片（protein chip）、同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）以及非标记定量（label-free）等。分离鉴定得到的蛋白质通过数据库比对和生物信息学分析进行蛋白质结构和功能预测，目前常见的蛋白质数据库有Swiss-PROT、SMART、PDB、HSSP、EMBL、CITH、NCBI等[25]。用蛋白质组学研究方法，可以分析植物生长发育中不同阶段、不同组织在特异条件下的蛋白质结构和蛋白表达模式，筛选出差异表达的蛋白，进行功能验证，已广泛应用于植物响应逆境胁迫机制的研究中[26]。如应用蛋白组学技术分析水稻、油菜、大豆、菠菜、棉花等在干旱、高温、低温、盐、重金属等非生物胁迫和病虫害等生物胁迫下的差异蛋白表达模式，为揭示其逆境应答机制奠定了基础，也为抗逆品种的培育和遗传改良提供了重要理论依据[27-31]。

低温胁迫会诱导植物体内大量基因的表达，产生冷胁迫响应蛋白，探究低温环境下的蛋白表达谱，能动态性地反映植物细胞和组织在特定条件下所处状态。在植物响应低温蛋白質组学研究中，分析较多的有拟南芥、盐芥、水稻、小麦、玉米等。如：运用双向荧光差异凝胶电泳和串联质谱技术分析低温胁迫下拟南芥亚细胞结构蛋白质组早期变化时，发现差异蛋白主要参与淀粉降解、三羧酸循环和蔗糖代谢途径[32];Gao 等[33]运用质谱技术对不同时长（6 h及2、5、24 d）低温胁迫后的盐芥进行蛋白质差异表达分析，表明低温胁迫蛋白主要参与光合作用、RNA 新陈代谢、能量代谢和细胞之间的信号传导等，且随着低温胁迫时间的延长，差异蛋白表达越多。利用高通量蛋白质组学技术，分析水稻叶片响应不同程度低温的蛋白质组动态变化特征，共在水稻叶片中鉴定到504种低温响应蛋白质，其中特异表达蛋白主要涉及光合作用中的叶绿素a/b结合蛋白、光系统Ⅱ作用中心P680叶绿素a载脂蛋白、放氧复合体蛋白、糖酵解中的相关酶、氧化平衡系统中的超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶、过氧化物酶以及低温信号转导过程中的小G蛋白、钙网蛋白（CRT）、14-3-3蛋白等，这些特异表达蛋白为深入研究水稻低温应答的分子机理提供了重要证据[34-36]。小麦多属于耐寒性作物，但长时间零下低温也会对其生长造成损伤。Han等[37]对-5℃低温胁迫1 d和 3 d的小麦叶片进行蛋白质组学分析，发现抗坏血酸过氧化物酶、超氧化物歧化酶和LEA 等与胁迫应激/防御相关的蛋白，在小麦适应低温胁迫过程中特异性表达;霍望[38]也采用2-DE及质谱技术对耐寒型和低温敏感型小麦-5℃低温胁迫72 h后进行全蛋白分析，发现抗坏血酸过氧化物酶、半胱氨酸蛋白酶、二磷酸核酮糖羧化酶、磷酸核酮糖激酶等分别参与了低温胁迫下的氧化应激反应、蛋白质代谢、光合作用及信号转导过程，在小麦响应低温逆境中发挥了重要作用。利用iTRAQ定量蛋白质组学方法研究低温胁迫前后玉米叶片蛋白质表达情况，共鉴定到173个差异丰度蛋白，功能性分析发现这些蛋白主要在缓解光损伤、通过糖酵解产生更多能量、提高清除ROS的能力以及转录后调节和翻译后修饰等过程中发挥作用[39]。

蛋白质组学技术除了应用于研究不同低温敏感植物组织和器官对低温逆境的响应，在低温贮藏研究中也应用较多。Yun等[40]研究4℃下不同贮藏期的柑橘时发现，有56个差异蛋白主要参与糖代谢和氨基酸代谢。Yang等[41]运用稳定同位素代谢标记技术、反向液相色谱技术和质谱技术，对5℃低温下贮藏5个月的马铃薯进行蛋白质组分析，共检测到4 463个蛋白点，其中46个差异蛋白点主要与控制淀粉糖的转化相关。

植物耐寒性受多基因网络共同调控，生长过程中各种信号传导及代谢网络相互交错关联。采用多种蛋白质组学分析技术相结合方法，获得低温胁迫下植物特异蛋白变化及蛋白互作数据，可为揭示植物低温胁迫下蛋白质组整体耐寒机制提供依据。

3 代谢组学研究

代谢组学（metabolomics 或 metabonomics）是指对限定条件下的特定生物体或细胞中全部低分子（相对分子质量小于1 000）代谢产物进行定性和定量分析，是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新兴的一门交叉学科[42]。植物代谢组学主要研究不同物种、不同基因类型或生态类型的植物在特定生长条件下所有小分子代谢产物在种类、数量上的变化规律[43]。代谢产物是基因转录与蛋白修饰的最终产物，通过分析逆境条件下植物体代谢产物的变化，进而发现一些未知基因或蛋白的功能，为揭示植物逆境响应机制提供更多依据。植物代谢产物大体分为初生代谢物和次生代谢物两大类，与响应逆境相关的大多数为次生代谢物[44]，因此，代谢组学方法运用于研究植物响应逆境机制越来越受到研究者的青睐。

由于代谢组学分析对象的物理化学性质差异很大，植物体内代谢产物种类繁多，且理化性质不同，单一检测方法不能检测出所有代谢物，因此，代谢组学研究中常采用多种分离、检测方法相结合方法，以获得较为全面的代谢物组分。代谢组学常用的分析技术主要有：气相色谱（GC）、液相色谱（LC）、质谱（MS）、核磁共振（NMR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）。实际研究中一般采用联用技术：气相色谱和质谱联用技术（GC-MS）、液相色谱和质谱联用技术（LC-MS）和高效液相色谱和核磁联用技术（HPLC-NMR）等，目前色谱-质谱联用技术和核磁共振技术应用较为广泛。

代谢产物是生物体在不同生理生态条件下代谢水平的体现，植物处于高温、低温、干旱、盐、病原菌以及重金属等胁迫下都会在分子、细胞以及生理水平上进行调节，产生大量代谢物。在拟南芥低温胁迫研究中，Cook等[45]采用GC-TOF-MS 联合技术对低温下不同抗寒性拟南芥进行了代谢组分析，共检测出434种代谢产物，其中325种代谢物在响应低温过程中增加;Kaplan等[46]也通过GC-MS技术对低温胁迫下的拟南芥进行代谢组分析，发现在响应低温过程中植株体内的天冬氨酸、鸟氨酸、精氨酸含量增加。巴尔干苣苔是一种抗性很强的物种，为揭示其低温响应过程中的代谢组分变化，Benina等[47]利用 GC-MS 技术分别对4℃低温处理下的巴尔干苣苔、盐芥和拟南芥代谢水平进行了对比分析。其结果表明低温下巴尔干苣苔所产生的代谢物种类最多，主要是糖类、柠檬酸盐、甘油;拟南芥中腐胺和延胡索酸盐等有机酸较多;盐芥中则氨基酸类物质较多，三个物种在代谢水平上对低温作出了不同的响应。利用广泛靶向代谢组学技术对4℃低温驯化和-5℃冷冻处理的小麦幼苗进行代谢谱分析，发现4℃低温驯化后共有86个代谢物上调、137个下调，这些代谢物主要包括糖类、黄酮类、有机酸和植物激素等，它们主要参与精氨酸和脯氨酸代谢、半乳糖代谢以及植物次级代谢物合成等代谢通路;-5℃冷冻处理后，共检测到8个差异代谢物，主要包括脱落酸、茉莉酸-异亮氨酸等[48]。为探究不同品种玉兰低温胁迫下的代谢表型差异，采用GC-MS 技术对红花玉兰和白玉兰茎尖进行代谢组分析，发现4℃低温胁迫下红花玉兰主要积累氨基酸类和糖类代谢物，白玉兰仅积累氨基酸类代谢物[49]。Morsy等[50]采用HPLC技术对抗寒性不同的两个水稻品种进行低温胁迫下的代谢组学研究，发现它们在低温胁迫下可溶性糖类积累差异较大，且抗寒性较强的品种半乳糖和棉子糖积累增加，而低温敏感型水稻则积累减少。

植物在低温下会积累许多代谢产物，在代谢水平上响应温度胁迫。目前发现与植物响应低温相关的代谢物主要有糖类、氨基酸、有机酸、硫代谢物和三羧酸循环中间代谢物，对这些代谢产物进行功能分类和鉴定，进而确定其在植物低温胁迫下的代谢调控规律，即可从代谢水平上对低温应答机制进行分析。

4 展望

植物在低温条件下会在基因、蛋白、代谢物等不同层次作出响应，产生相应的差异表达基因、差异表达蛋白和特异性代谢产物。低温胁迫条件下，植物感受低温刺激后首先进行转录调控，启动与低温胁迫相关基因，合成应激蛋白，进而控制相关代谢物的合成。转录组学、蛋白质组学和代谢组学分别从RNA水平、蛋白质水平和代谢物水平揭示低温胁迫下植物在不同层次发生的变化，有助于挖掘与低温相关的新基因、新蛋白以及特异性代谢产物等，通过对这些基因、蛋白质和代谢物进行功能分析和鉴定，来为植物抗寒性基因工程和抗寒性植物品种的培育奠定理论基础。

当前对于植物低温胁迫响应机制的研究主要集中于单一组学或两个组学联合分析，只能在单一水平上反映低温调控网络。如转录组学是从RNA 水平上研究低温下转录基因的表达调控规律，蛋白质组学是研究转录后翻译得到的蛋白质变化规律，而代谢组学研究的是植物响应低温最终的体现形式，即代谢产物，三个“组学”技术从不同层次揭示植物低温胁迫下的响应机制。植物低温胁迫响应机制研究中，大多数采用一种“组学”或两种“组学”进行关联分析。然而低温条件下植物体内的基因调控网络和代谢途径是错综复杂的，单一“组学”的研究难以全面揭示植物在低温胁迫下的整个基因调控网络，因此今后的相关研究中，需要将基因组、转录组、蛋白质组以及代谢组等关联起来，结合差异基因功能分析、差异蛋白生物信息分析、差异代谢物生物信息分析和分子互作等，系统全面地解析植物低温胁迫响应机制。

植物对低温的抗性和适应性是植物器官、组织、细胞及亚细胞等多方面共同作用的结果，且同种植物的不同品种对相同条件的低温胁迫都可能存在不同的抗性调节机制。在今后的相关研究中，还需要对植物的不同器官或组织，采用多个“组学”相结合的方法进行深入探究，加强对低温条件下一些重要调控途径、特异功能蛋白和关键基因的挖掘，将有助于深入了解植物的抗寒机制，也可为进一步培育植物抗寒新品种提供更广泛的基因资源。

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