蒋向辉，杨永平，谭 荣

（1.凯里学院，贵州凯里 556011；2.贵州奥特药业有限公司，贵州凯里 556011）

灵香草（Lysimachia foenum-graecumHance）系报春花科珍珠菜属植物［1］，其味香气浓，是我国特色的传统药用植物，其全草可以作药用，常用于解热、治牙痛、活血和驱虫.当前对有关灵香草化学成分的研究相对较少，可能与灵香草挥发性成分极大有关，现已分离并鉴定出β-谷甾醇、苯甲醇、棕榈酸、百里香酚、三萜皂苷、苯乙酮、烯酸乙酯、香荆芥酚、豆衡醇、豆街醇、槲皮素等化合物［2］.大量的研究表明，灵香草中富含黄酮类成分［3］，其中黄酮醇类化合物槲皮素在多种药材中是抗菌消炎和抗肿瘤的主要成分.但迄今为止对灵香草槲皮素含量的提取分离与测定的研究尚未见报道.

灵香草萃取物通常采用乙醇或甲醇等有机溶剂萃取，但以单一有机溶剂作为萃取物往往收率较低，并且由于灵香草中挥发性成分较多，在提取过程中导致类黄酮损失较多，限制了灵香草类黄酮的开发与使用.本研究拟以2 mol/L的盐酸甲醇溶液为提取溶剂提取灵香草类黄酮，采用HPLC 检测方法测定灵香草甲醇提取物中槲皮素含量，为灵香草药材质量的检测和槲皮素的开发利用提供技术参考.

1 试验材料

材料采自云南、广西和贵州省的灵香草产区，由贵州奥特药业有限公司提供（见表1）.

表1 供试样品来源表

2 试验仪器与试剂

2.1 试验仪器

试验仪器有日本岛津LC-30A 型高效液相色谱仪，Wondasil C18反向色谱柱，KQ2200DV超声波清洗机，R-1002型旋转蒸发仪，万能粉碎机，101A电热恒温鼓风干燥箱，BSA224SCW 电子分析天平和UV-8000双光束紫外可见分光光度计.

2.2 试验试剂

试验用试剂有乙酸乙酯和甲酸（购自怀化新科仪化学试剂公司，均为色谱纯），有机试剂甲醇、甲苯（购自湖南长沙华腾试剂有限公司），无机试剂盐酸、氢氧化钠等（购自湖南怀化市玻璃仪器化学试剂有限公司），槲皮素对照品（购自中国药品生物制品检定所）.

3 试验方法

3.1 色谱条件选择

色谱柱采用Wondasil C18 反向色谱柱，通过紫外扫描，检测发现槲皮素在波长为375 nm 时有最大吸收，特将HPLC 检测的波长设定为375 nm.通过考察甲苯-乙酸乙酯-甲酸按不同比例混合（10∶6∶4，10∶5∶2和10∶8∶1）对峰形及分离度影响，将槲皮素标准液HPLC 图与灵香草盐酸甲醇提取液HPLC 图进行比较，当甲苯-乙酸乙酯-甲酸配比为10∶8∶1 时保留时间相对稳定，样品分离明显（见图1）.由于槲皮素保留时间为19 min，时间相对较长，因此，加大流速为1.5 mL/min，延长检测时间到30 min，色谱柱温度为实验室温度（25 ℃）.

图1 槲皮素对照品（A）与灵香草盐酸甲醇提取液（B）的色谱图

3.2 标准曲线的绘制

3.2.1 对照品溶液的配制

槲皮素对照慢速离心后，称量5.0 mg，先用35～40 mL浓度为2 mol/L的盐酸甲醇溶解，再用盐酸甲醇定容至50 mL，即得100 µg/mL 的槲皮素对照品溶液，再从该容量瓶中分别量取2、3、4、5、6、7、8 mL槲皮素对照品溶液，用盐酸甲醇定容至10 mL，制得浓度为20、30、40、50、60、70、80µg/mL 的槲皮素对照品溶液.

3.2.2 供试品溶液的制备

精密称取灵香草粉末0.5025，0.5050和0.5075 g三份，分别加入250 mL的玻璃圆底烧瓶，再加100 mL的盐酸甲醇溶液，固定于回流冷凝装置，调整温度到80 ℃，回流加热1.5 h，冷却后，迅速减压抽滤，将滤液置于80 ℃下旋转蒸发30 min，得到约2 mL 盐酸甲醇溶液，作为供试品溶液备用.

3.2.3 线性关系的考察

使用注射器量取上述不同浓度的母液1.5 mL，采用0.22µm 有机相系滤膜过滤，分别置于不同刻度试管中.按3.1得到的色谱条件，进行高效液相色谱检测，测定不同浓度槲皮素的峰面积，采用SPSS19.0 软件分析槲皮素含量与峰面积之间的线性关系，得到线性回归直线方程为y=78257x+43567，并以峰面积为纵坐标（Y），槲皮素的质量体积比浓度为横坐标（X），得到线性曲线图2，从图中可以看出，当槲皮素质量体积比浓度在25～75µg/mL时，浓度与峰面积线性关系良好.

图2 槲皮素标准曲线

3.3 精密度试验

使用注射器吸取浓度为50µg/mL 的槲皮素对照品溶液1.5 mL，按3.1得到的色谱条件，进行高效液相色谱检测，测定不同浓度槲皮素的峰面积，共得6 组数据（n=6），最后数据及其处理结果如表2所示.从表2 可以看出，槲皮素峰面积标准偏差与计算结果算术平均值的比值，即相对标准偏差（RSD）为1.83%，小于2.0%，表明该高效液相色谱仪精密度较好.

表2 精密度试验结果

3.4 重复性试验

使用注射器分别吸取上述3.2.2所制备的供试品溶液1.5 mL，按3.1得到的色谱条件，进行高效液相色谱检测，测定不同浓度槲皮素的峰面积，共得6组数据（n=6），最后数据处理结果如表3所示.从表3可以看出，供试品峰面积相对标准偏差RSD 为1.18 %（＜2.0 %），表明样品制备过程稳定、成分变化小，制备方法重复性好，用于测定槲皮素含量数据可靠.

表3 重复性试验结果

3.5 稳定性试验

按上述3.2.2法制备出槲皮素供试品溶液后，用移液器量取供试品溶液1.5 mL，并通过0.22µm有机相系滤膜过滤，分别于0，2，4，6，8，10 h等6个时间段进行，进样稳定性检测，最后检测数据及其处理如表4中所示.从表4可以看出，槲皮素供试品峰面积相对标准偏差RSD 为2.17%，小于2.5%，表明槲皮素在10 h内性质稳定，含量变化小，该检测的方法可靠.

表4 稳定性试验结果

3.6 加样回收率试验

取灵香草（LXIlfg01）粉末2份，准确称定质量为0.5 025，0.5 104，0.5 003，0.5 163，0.5 107和0.4 933 g，按照上述3.3法制备6组槲皮素含量已知的灵香草供试品溶液，再分别向6 组供试品溶液加入1.8、2.0、2.2、1.8、2.0和2.2 mL浓度为100µg/mL的槲皮素对照品溶液，即分别加入18、20、22、18、20 和22µg 的槲皮素对照品，即得到6 组不同的加有不同量对照品的用于加样回收检测的供试品溶液.按3.1 所设定的HPLC色谱条件，参照3.2.3项方法测定不同样品中槲皮素的峰面积，标测混合后槲皮素检测量，共得6 组数据（n=6），计算供试溶液中加入标品后的加样回收率.其数据及其处理结果如表5所示.

表5 加样回收试验结果

由表中数据得出：槲皮素的加样回收率为96.44%，在所规定范围93.45%～100.75%内，相对标准偏差为2.49%，未超过规定的标准（5%），即该方法较准确.

4 含量测定结果与分析

4.1 提取液峰面积测定

准确称取7个不同来源的灵香草样品0.5 025、0.5 050、0.5 075 g，按上述3.2.2 法制备出灵香草供试品溶液后，用注射器吸取供试品溶液1.5 mL，参照3.2.3 项方法用进样针精密吸取20 µL，根据3.1设定的色谱条件测定样品槲皮素含量，最后数据如下表6所示.

表6 各产地灵香草中槲皮素的含量

续表6 各产地灵香草中槲皮素的含量

4.2 提取液中槲皮素浓度的计算

根据3.2.3得到的线性方程y=36 402x+58 412，可变换为x=（y-58 412）/36 402，根据峰面程计算得各产地灵香草中槲皮素的含量，计算结果如表6所示.由实验数据可得出，各批次灵香草中都含有较多的槲皮素，以来自广西来宾（LXIlfg04）的灵香草槲皮素含量相对较高，为0.723 mg/g，以来自贵州兴义市（LXIlfg01）的灵香草槲皮素含量相对较低，为0.443 mg/g.

5 小结与讨论

本研究为了测定灵香草中槲皮素含量，对灵香草槲皮素的提取液进行了摸索，找到了提取率较高的盐酸甲醇混合提取溶剂.由于槲皮素极性较芦丁小，本研究采用反向色谱柱时，适当加大流速到1.5 mL/min，保留时间19 min 时，槲皮素能得到较好的分离；通过流动相甲苯、乙酸乙酯和甲酸的不同配比的筛选，找到了能有效分离灵香草槲皮素的理想配比，即甲苯：乙酸乙酯：甲酸=10∶8∶1；通过最大吸收波长分析，找到了槲皮素的紫外检测最大吸收波长为375 nm；以槲皮素保留时间和峰面积进行槲皮素定性与定量分析，峰面积与含量绝对相关系数是0.9998，相对标准偏差（RSD）变化范围为1.83%～2.49%，加样回收率平均为96.44%，表明采用HPLC 法检测灵香草甲醇提取物中槲皮素含量灵敏度高、可重复性好，本研究为灵香草药材成分的开发利用提供了较好的参考.

本实验对槲皮素的提取方法进行了改进，刘少静等［4］以55%的乙醇溶液为提取液，测得沙棘果粉中槲皮素含量为0.128 mg/mL，王珍等［5］以70% 的乙醇为提取液，测得山楂中槲皮素含量为0.664 mg/mL，本研究选用盐酸甲醇的混合溶液为提取液，再通过回流提取后得到灵香草中槲皮素含量最高为0.723mg/mL.在本研究中灵香草槲皮素色谱峰保留时间较长，但能将槲皮素从类黄酮中较好地分离出来，这为今后从其它药材中分离槲皮素类黄酮提供了较好的参考.