张福娟

(朝阳师范高等专科学校 生化工程系，辽宁 朝阳 122000)

0 引言

我国是世界畜牧生产大国之一.随着畜牧业的发展，人畜共粮矛盾凸显，环境污染的恶化和农药抗生素的残留造成的各种食品安全问题也日益增多，一种能够缓解这些问题的方法便是研发微生态发酵饲料[1-3].微生态发酵饲料通过菌种发酵产生丰富的酶系和益生菌，减少甚至替代抗生素的使用，降低环境污染，减少农药残留，提高动物的生产性能和肉品的安全性，是当前畜牧养殖发展的新趋势[4-5].目前，微生态发酵饲料多以单一菌种为主，这类发酵方式往往功效小且效果单一.多菌种发酵饲料能够改善此类问题，但多菌种发酵方式由于受到多菌种之间生长条件的相互制约，发酵过程比较复杂，发酵产物难以控制[6-7]，所以多菌种共同发酵生产饲料是研究难点[8].

本研究中以饲料常用原料麸皮作为主要发酵基质，以黑曲霉和热带假丝酵母作为发酵菌剂进行微生态固态发酵饲料实验，成品最终的粗纤维和粗蛋白含量作为衡量指标，探索微生态固态发酵的最佳工艺参数，为微生态发酵饲料的生产和研发提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料和菌种

麸皮：市售.

黑曲霉和热带假丝酵母：均购于中国科学院微生物研究所菌保中心.

1.1.2 药品

氢氧化钠、98%硫酸、无水硫酸铜、硫酸钾、甲基红、无水乙醇、溴甲酚绿、硼酸、蔗糖、硫酸铵，全部为分析纯试剂；石蕊试纸.

1.1.3 仪器与设备

微量凯氏定氮装置，DHG-914385-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱(上海沪粤明科学仪器有限公司)，9052型电热恒温培养箱(苏州江东精密仪器有限公司)，AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，SW-CJ-2FD型超净工作台(上海予腾生物科技有限公司)，高压灭菌锅(上海茸研仪器有限公司)，容量瓶，移液管，酸式滴定管，锥形瓶，电子万用炉.

1.1.4 培养基

1.1.4.1 PDA固体培养基

取去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1000 mL ,80 ℃浸泡1 h，用纱布过滤，然后补足失水至1000 mL,121 ℃灭菌20 min，即得20%马铃薯浸汁，贮存备用.每100 mL马铃薯浸汁加入2 g葡萄糖，加热煮沸后每100 mL马铃薯浸汁加入2 g琼脂，继续加热融化并补足失水,分装，加塞，包扎,高压蒸汽灭菌(121 ℃灭菌20 min),卧斜，使试管内部液体呈斜面状态，待冷却后30 ℃恒温培养24 h，排除冷凝水，观察试管培养基表面光滑无菌则可以接菌.

1.1.4.2 PDA液体培养基

马铃薯20%，葡萄糖2%.具体制作：取200 g去皮的马铃薯，切成块煮沸30 min，然后用200目纱布过滤，再加入上述其他原料补足1000 mL水，121 ℃灭菌20 min.

1.1.4.3 麦芽汁培养基

12°Bx 麦芽汁，121 ℃灭菌20 min.

1.1.4.4 固态发酵培养基

装料：按照一定的含水量对麸皮进行拌料，每kg混合料加入2 mL浓硫酸；装入三角瓶内(50 g/瓶)，高度20～25 cm；用棉塞堵塞封口，再用16层无菌纱布封口；高压蒸汽灭菌，100 Pa 灭菌20 min；自然冷却.

接菌：按照一定的比例将斜面发酵菌株接种至物料上，一定温度下培养一定时间.

1.2 方法

1.2.1 实验方法

1.2.1.1 菌种活化

将保存的菌种分别接到PDA斜面培养基中，30 ℃恒温培养 24～72 h，再转接2～3次，备用.

1.2.1.2 种子液的制备

接种一环经活化后的黑曲霉于PDA液体培养基中，30 ℃恒温培养 24～72 h；接种一环经活化后的热带假丝酵母于麦芽汁液体培养基中，30 ℃恒温培养 24 h.

1.2.1.3 固态发酵实验

将制备好的黑曲霉种子液和热带假丝酵母种子液按照一定配比混合，按照不同的发酵参数进行组合，开展发酵实验，每个实验重复3次.发酵结束后，60 ℃下烘干，测定发酵产物的粗蛋白和粗纤维含量.

1.2.2 测定方法

粗纤维的测定：饲料中粗纤维含量的测定方法[9].

粗蛋白的检测：采用凯氏定氮法检测[10].

1.2.3 单因素实验

将发酵影响因子梯度化设计，其中含水量分别为40%、50%、60%、70%和80%，发酵温度分别为26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃和38 ℃，发酵时间分别为24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，接种量分别为5%、10%、15%、20%和25%.四个因素、五个水平进行单因素实验，以粗蛋白和粗纤维含量为衡量指标，确定单因素最佳发酵条件，为正交试验水平的选取提供主要参考.

1.2.4 正交试验

以粗蛋白、粗纤维含量为评价指标，依次进行黑曲霉与热带假丝酵母比例、发酵温度、发酵时间和含水量的单因素实验, 并确定四因素三水平的最佳参数，进行单因素分析.

2 结果与讨论

2.1 含水量对发酵底物的影响

从表1可以看出，含水量单因素实验中黑曲霉固态发酵含水量在40%～70%时，蛋白质含量随含水量的升高而增加，在70%以上却又随含水量的升高而逐渐降低，最优含水量为70%，粗蛋白质含量为22.5569%；粗纤维含量呈现先迅速下降再上升趋势，含水量70%时粗纤维含量最低，为5.14%.热带假丝酵母发酵在含水量40%～70%时，蛋白质含量随含水量的升高而增加，之后随着含水量增加蛋白质含量下降，因此最优含水量为70%，粗蛋白质含量为18.5731%，此时粗纤维含量也是最低，为8.34%.所以，正交试验选取含水量水平参数分别为60%、70%和80%.

表1 不同含水量对黑曲霉和热带假丝酵母单菌固态发酵产物的影响 单位：%

2.2 温度对发酵底物的影响

从表2可以看出，温度单因素实验中黑曲霉固态发酵最优温度为29 ℃，粗蛋白含量最高，为22.9314%，粗纤维含量最低，为6.40%.热带假丝酵母固态发酵蛋白质含量最高、粗纤维含量最低点为32 ℃.所以，正交试验选取温度参数分别为29 ℃、32 ℃和35 ℃.

表2 不同温度对黑曲霉和热带假丝酵母单菌固态发酵产物的影响 单位：%

2.3 时间对发酵底物的影响

从表3可以看出，时间单因素实验中，黑曲霉固态发酵随时间的增长粗蛋白含量逐渐增加，粗纤维含量逐渐降低，变化幅度最大是在前期发酵24～48 h，随后缓慢增长.热带假丝酵母也是在24～48 h指标变化幅度最大.可见，两类菌种发酵活跃期接近，有利于最大发挥效能.正交试验选取时间水平分别为48 h、60 h和72 h.

表3 不同时间对黑曲霉和热带假丝酵母单菌固态发酵产物的影响 单位：%

2.4 接菌量对发酵底物的影响

从表4可以看出，接菌量单因素实验中黑曲霉固态发酵最优接菌量为20%，热带假丝酵母固态发酵最优接菌量为10%.所以，正交试验选取接种总量为20%，黑曲霉与热带假丝酵母菌种配比分别为2∶1、1∶1和3∶1.

表4 不同接菌量对黑曲霉和热带假丝酵母单菌固态发酵产物的影响 单位：%

2.5 混菌的正交试验

由表5可见，以粗蛋白含量为衡量指标，得黑曲霉和热带假丝酵母混菌发酵影响次序依次为B>C>A>D，粗蛋白含量最高的最优组合为B2C1A2D3.以粗纤维含量为固态发酵衡量指标，得黑曲霉和热带假丝酵母混菌发酵影响次序依次为B>C>D>A，粗纤维含量越低越符合微生态发酵饲料需要，所以最优组合为B2C1D3A2.两个衡量指标得到一致的参数组合，这也与理论预期一致.

表5 黑曲霉和热带假丝酵母混菌固态发酵正交试验检测结果

3 结论

黑曲霉和热带假丝酵母两菌种组合发酵高产蛋白酶、纤维素酶，提高饲料利用率，即最优参数为：麸皮含水量70%，菌种配比为黑曲霉∶热带假丝酵母=2∶1，发酵温度为32 ℃，发酵时间为72 h.在此工艺参数下固态发酵麸皮，蛋白质含量最高，粗纤维含量最低，符合微生态发酵饲料产品预期.