万相勇，徐雪晶，徐英杰，赵锦漪，肖 明，马小芳，杨世龙*

(1.南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037;2.南京林业大学 现代分析测试中心，江苏 南京 210037;)

核磁共振技术普遍用于有机化合物的结构鉴定，随着高强度磁场以及傅里叶变换技术的应用，仪器的各项性能得到极大的改善，使得其应用于定量分析成为了可能。定量核磁共振技术(Quantitative Nuclear Magnetic Resonance，QNMR))是一种通用技术，只要含1H、19F、13C、31P等原子就可以进行定量，与其它定量方法相比，QNMR具有诸多优点，例如，不需要自身的标准品，不需要引入校正因子，对样品无破坏，定量结果准确，重现性好[1]，因此，近十年，定量核磁工作技术已广泛用于制药、食品、生命科学、化工等行业，并被中国药典、美国药典、欧洲药典收录，已成为一种常用的定量手段。为快速、方便地进行QNMR实验，本文总结了QNMR的原理、内标峰和内标物的选择、实验参数设置以及实施方法，以期为科研工作提供参考。

1 QNMR的原理

QNMR常用内标法对化合物进行定量，内标法以结构已知的化合物作为内标物，精确称量内标物和待测样品，用氘代试剂配成混合溶液，选取合适的仪器参数进行测量，通过定量峰的面积比，计算得到待测样品的含量，计算公式如下[2]：

式中，Px和Pstd分别代表样品和内标物的纯度， Ix和Istd分别代表样品和内标物中定量峰的峰面积，Nx和Nstd分别代表样品和内标物定量峰对应的氢原子个数，Mx和Mstd分别代表样品和内标物的摩尔质量，mx和mstd分别代表样品和内标物的质量。

2 实施步骤

QNMR的一般步骤是：首先对待测样品进行表征，对峰进行归属，选取合适的氘代试剂、内标物和定量峰，然后将内标物和被测物质准确称重，用氘代试剂溶解，放入仪器中，调节相关仪器参数，进行测试，根据公式计算含量。为进一步验证方法的准确性，需要进行参数优化、专属性、重复性等相关实验。

2.1 氘代试剂的选择

氘代试剂的选择，不仅要考虑溶解性能，而且还要考虑到溶剂对化学位移的影响。主要从以下几点出发[3-4]，①溶剂峰与样品峰要分离。②让定量峰尽量与其它峰有更大的分离度，必要时可考虑使用混合溶剂，混合试剂可以使在单一试剂中不能完全分离的定量信号得到完全分离，从而达到单一试剂无法达到的效果。③注意温度对氘代试剂的影响，使用易挥发的溶剂，例如氘代氯仿，不易升温，以免加快挥发，影响测试结果。

2.2 定量峰和内标物的选择

定量峰的选择对测试结果影响大，在选择定量峰时，应从以下几方面着手[5]：①定量峰与其它峰分离度要好。②首选单峰，其次选择带有裂分的峰。③对于定量氢谱，选择非活泼氢，定量结果会更加准确。

内标物的选择除了满足定量峰的要求外，还需要考虑以下几点：①内标物结构与性质稳定，不与溶剂、样品等反应。②纵向驰豫时间(T1)较短。③内标物定量峰对应的原子核的化合物环境最好与样品的相似。④廉价，易得，无毒或低毒。常见的内标物有苯、苯甲酸、二甲基亚砜、马来酸等。

总之，定量峰与内标物的选择相互配合，各个因素综合考虑，除上述因素外，最好让样品的定量峰与内标物的定量峰位置相近，且不相互干扰，这样，测试结果会更加准确。

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2.3 主要参数设置

由QNMR的计算公式可以看出，影响结果的主要因素只有峰面积是需要测量的，因此，与仪器参数设置密切相关，影响峰面积的仪器参数主要有仪器的磁场强度、扫描次数、驰豫延迟时间、采样时间、增益值、脉冲程序等[6-7]。

2.3.1 磁场强度

磁场强度是仪器的主要参数，一般情况下，仪器磁场强度越高，灵敏度越高，分辨率越高，检测限就可能会很低，更加适用于微量样品的检测。通常情况，400MHz以上的核磁共振谱仪用来做QNMR研究就足够了。

2.3.2 驰豫延迟时间

驰豫延迟时间(D1)是一个重要的参数，D1主要与化合物中原子的纵向驰豫时间(T1)相关。在QNMR实验时，一般要求D1≥5T1，如果D1过短，纵向磁化矢量不能完全恢复，所收集的峰面积不准确，就会造成结果不准确；但如果D1过长，则造成测试时间很长。因此，获得合适D1值很重要。实验前最后测量下T1，从而确定合适的D1值。一般有两种途径，第一种，测量精确的T1值，核磁软件一般带有测量T1值的功能，可利用软件进行测试。第二种可以采集不同D1值下的图谱，当定量峰峰面积不再变化时，可认为此时的D1值为最佳值[8]。此外，对于13C QNMR，由于13C的T1值很大，可加入驰豫试剂，缩短T1值，常用的弛豫试剂为乙酰丙酮铬[9]。

2.3.3 采样时间

采样时间指信号衰减为噪音所用的时间，采样时间过短，信号未完全衰减即停止采集，则会发生截尾现象，傅里叶变换后，可能产生错误的峰，如果采样时间过长，谱图中含有过多的噪音，造成分辨率下降，同时实验时间过长。

2.3.4 扫描次数

扫描次数对提高谱图的信噪比有很大帮助，扫描次数越多，信噪比越大，定量结果也更准确，但扫描次数太多，实验时间较长，1H QNMR、19F QNMR、31P QNMR次数可以低，一般16～128次，对于13C QNMR扫描次数可能需要上千次。

2.3.5 其他参数

影响QNMR的参数有很多，有些参数虽然影响不明显，但如果进行优化，定量效果会更好，例如，脉冲角度最好选用90°脉冲角。在确保信号不会溢出的情况下，增益值最好选择最大值并保持一致，以提高信噪比。共振频率中心最好在样品和内标物定量峰之间，以达到最佳的共振效果。此外，在测试时，采用溶剂峰压制、旋转样品等方法，也可以提高信噪比，提高测试准确度[6]。

2.3.6 数据处理

数据处理时，不仅要对每张图谱进行仔细的化学位移校正、相位校正和基线校正；而且还可以采用其它方法，提高QNMR的准确度，例如，采用窗函数对数据进行处理，可以提高信噪比；积分应该采用固定范围的方式进行积分，确保积分的准确性；进行冲零操作，可以提高图谱的分辨率。

3 方法学验证

对QNMR方法学的验证主要从线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收等方面进行考察，考察合格，方能作为定量方法对样品进行测试[10-13]。

3.1 线性关系

考查线性关系时，可配制不同浓度的样品，加入相同浓度的内标物，同时测定谱图，以样品定量峰与内标定量峰的面积比为纵坐标，以样品与内标的质量比为横坐标，进行线性回归，绘制曲线，线性相关系数越接近1，线性关系越好。

3.2 精密度实验

考查精密度时，制备一个样品，加入内标物后，连续测量5次以上，计算样品定量峰与内标定量峰面积比的RSD值，一般要求RSD<2%。

3.3 重复性实验

平行制备5份以上样品和内标的混合供试液，同一条件下测定谱图，根据两者定量峰的面积比，计算样品的浓度，根据多次计算结果求出RSD值，一般要求RSD<2%。

3.4 稳定性实验

制备一个含有样品和内标物的供试液，每隔一定的时间测定一次谱图，计算样品定量峰和内标定量峰的面积比，并计算RSD，可以得到稳定性的结果，一般要求RSD<2%。经上述实验后，线性关系好，精密度高、重复性好、稳定性好的定量方法才可以用于测定实际样品。

4 总结

QNMR技术集样品定性与定量于一体，与其它定量方法相比，具有诸多优势，已成为当今的研究热点之一。随着高场核磁和高端软件的研发，QNMR技术在药物、食品、生命科学、化工等领域应用前景将更加广泛。故本文综述了QNMR的原理、内标峰和内标物的选择、实验参数设置及主要方法学验证实验，以期为QNMR实验提供参考。