张慧敏，彦培傲，徐志杰，鞠玲燕

(1.山东省海洋经济藻类资源开发与利用工程技术协同创新中心，山东 威海 264300；2.威海海洋职业学院海洋生物与医药系，山东 威海 264300;3.威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东 威海 264205)

如果化妆品遭受微生物的侵入，品质将会受到严重影响,影响使用者健康,通常加入防腐剂抑制微生物。水杨酸为有机酸类防腐剂，具有较强的抗真菌作用[1],也有较好美容效果[W]，故水杨酸常被商家利用。但若过量使用水杨酸，会危及健康。我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)规定水杨酸在化妆品中的限量为0.5 %，而且，除香波外，不得用于三岁以下儿童使用的产品中[3]。

《化妆品安全技术规范》(2015年版)规定水杨酸的测定方法为高效液相色谱法[3]，而且目前已报道测定水杨酸的方法也多为高效液相色谱[4-7]，液相色谱法简便，快捷。本文对高效液相色谱法检测化妆品中水杨酸含量的不确定度进行了评定，不确定度是测量结果的定量表征，检测结果是否有效，主要在于其不确定度的多少[8]。在检测过程中，因素复杂和检测结果评定的多样性，导致结果会带有一定的不确定性，影响产品合格判定、司法裁定等[9-11]。为此，本文依据JJF1059.1-2012计量技术规范[12]，参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)[3]中高效液相色谱法测定化妆品中水杨酸含量，建立数学模型，对检测结果进行不确定度评定，希望为评定测量方法和结果的可靠性、准确性提供了科学依据。

1 仪器、试剂与材料

Aglient 1260高效液相色谱仪，配在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器，美国Aglient公司；Ohaus DV215CD电子分析天平(d=0.1mg)；超声波提取仪(SB5200)：上海诺顶仪器设备有限公司。计量检定合格的A级玻璃量器。

甲醇、磷酸，色谱纯，CNW公司；水杨酸(95%)，Dr.Ehrenstorfer；乳液样品(市售)。

2 实验方法

2.1 环境条件

温度(22±3)℃，相对湿度≦75%。

2.2 标准溶液的配制

20 mg/mL标准储备液：称取1000 mg水杨酸于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇+水(75+25)溶解，配置成50 mL标准储备液，避光保存。

1000 μg/mL标准中间液A：量取0.5 mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇+水(75+25)溶解，配置成10 mL标准中间液A。

10 μg/mL标准中间液B：量取 1 mL标准中间液A于100 mL容量瓶中，用甲醇+水(75+25)溶解，配置成100 mL标准中间液B。

标准工作溶液：分别精密加入标准中间液B 500μL，标准中间液A 10,50,100,200μL置于2 mL棕色进样瓶中，用醇+水(75+25)溶液定容至1mL，浓度依次见下表，作为S1～S5，现用现配，如表1所示，供高效液相色谱测定。

表1 标准溶液配制表

2.3 样品前处理

取样品0.2500 g于25 mL具塞比色管中，加入20 mL甲醇水溶液(75+25)，涡旋1min后，用超声波提取仪提取15 min，用甲醇+水(75+25)溶液定容至25 mL，用0.45μm有机滤膜过滤，保存于2 mL棕色进样瓶中作为待测溶液。

2.4 色谱条件

Aglient C8色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流速：1.2mL/min；柱温：25℃；进样体积：20 μL；检测波长：300 nm。

2.5 数学模型

式中：X——试样中水杨酸的质量分数，单位为μg/g；

c——由标准工作曲线中得到的水杨酸含量，单位为μg/mL；

V——样液最终体积，单位为mL；

m——最后样液的质量，单位为g；

D——稀释倍数。

3 结果与分析

3.1 不确定度来源分析

结合检测流程及不确定度数学模型分析，化妆品中水杨酸含量测定的不确定度主要来源于测量重复性、标准品配制、样品溶液、标准曲线拟合引入。

3.2 不确定度分量的量化

3.2.1 重复性测量引起的不确定度

平行制备6份样品，分别加入标准中间液A 10μL，使得样品加标浓度为40μg/g。6份加标样品的水杨酸测定值分别为39.27 ,40.70 ,36.49,37.29,38.11 ,40.81 μg/g，平均为38.78 μg/g。单次测量结果的标准偏差为：

(其中n=6)

因实际进行两次平行样品检测，引入的标准不确定度为：

μg/g (其中m=2)

由重复性测量引起的相对标准不确定度：

3.2.2 标准品引入的不确定度

电子天平品牌，型号为Ohaus DV215CD，1级，该天平最大允许误差为0.1mg，引入的标准不确定度为：

实际上进行空盘和毛重两次称量，产生的不确定度u(m)为：

称量1000.00mg水杨酸标准品，相对标准不确定度urel(m1)如下：

3.2.3 配制标准品引入的不确定度

使用到容量瓶的规格有100 ,50,10mL，刻度吸管1mL、移液管1mL，经检定都是A级。

3.2.3.1 1mL刻度吸管移取0.5mL溶液引入的不确定度

(1)JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》规定，1mL A级刻度吸管移取0.5mL溶液，最大容量允差为±0.008mL，标准不确定度为：

(2) 温度引入的不确定度：实验室温度波动通常为±3℃，水的膨胀系数为2.1×10-1/℃，按照矩形分布，标准不确定度为：

(3) 合成标准不确定度u(v0.5)

(4) 引入的相对标准不确定度urel(v0.5)

3.2.3.2 1mL移液管引入的不确定度

(1)校准引入的不确定度：JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》规定，1mL A级移液管最大容量允差为±0.007mL，标准不确定度为：

(2) 温度引入的不确定度：标准参照3.2.3.1(2)，由温度引入的标准不确定度为：

(3) 合成标准不确定度u(v1)

(4) 相对标准不确定度urel(v1)

3.2.3.3 100mL容量瓶引入的不确定度

(1) 校准引入的不确定度：JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》规定，100mL A级容量瓶最大容量允差为±0.10mL，标准不确定度为：

(2) 温度引入的不确定度

(3) 合成标准不确定度u(v50)

(4) 相对标准不确定度urel(v100)

3.2.3.4 50mL容量瓶引入的不确定度

(1) 校准引入的不确定度：JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》规定，50mLA级容量瓶最大容量允差为±0.05mL，标准不确定度为：

(2) 温度引入的不确定度

(3) 合成标准不确定度u(v50)

(4) 相对标准不确定度urel(v50)

3.2.3.5 10mL容量瓶引入的不确定度

(1) 校准引入的不确定度：JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》规定，10mL A级容量瓶最大容量允差为±0.02mL，标准不确定度为：

(2) 温度引入的不确定度

(3) 合成标准不确定度u(v10)

(4) 相对标准不确定度urel(v10)

以上过程引入的相对不确定度为：

3.2.4 样品溶液浓度引入的不确定度

3.2.4.1 样品称重

天平品牌型号为Ohaus DV215CD，为1级，其最大允许误差为0.1mg，根据矩形分布，称量误差引入的标准不确定度为：

实际上进行空盘和毛重两次操作，不确定度u(m)为：

用上述天平称取0.2500g，引入的相对标准不确定度urel(m2)为：

3.2.4.2 定容引入的不确定度

1mL定容引入的不确定度

(1)校准引入的不确定度：评定标准参照3.2.3.2(1)，标准不确定度为：

(2) 温度引入的不确定度：

(3) 合成标准不确定度u(v1)

(4) 1mL移液管引入的相对标准不确定度urel(v2)

3.2.5 由标准曲线引入的不确定度

由五组浓度进行标准曲线拟合，如表2所示。

表2 由标准曲线引入的不确定度计算表

标准不确定度公式为：

式中： S——水杨酸溶液响应信号残差的标准差；

b———回归方程斜率；

m———待测物的测定次数；

n———标准溶液的测定次数；

xi———从标准曲线得出的水杨酸标准溶液的测定值；

yi———是相对于xi的测定值。

由标准曲线拟合引入的不确定度为U(curve) =0.01875233，相对不确定度为：Urel (curve)= 0.0004836

3.2.4 由方法回收率引入的不确定度

3.2.5 由分析仪器引入的不确定度

液相色谱仪安捷伦1260 (HDle-2017-12-2507612)的校准证书提供其相对标准不确定度urel (e) =0.04。

3.3 合成标准不确定度u(X)的计算

通过以上分析，该方法各分量不确定度见表3。

表3 各分量的相对标准不确定度分量表

合成相对标准不确定度为：

因此，合成不确定度为：

U(x)=0.05550×38.78=2.1523μg/g

3.4 扩展不确定度U的计算

以95%为置信概率，合成标准不确定度乘以2(k=2)，得到扩展不确定度为：

U=U(x)×k=2.1523×2=4.3046μg/g

3.5 测量不确定度的结果报告

按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)测定乳液中水杨酸，本乳液中水杨酸测定结果表示为(38.78±4.3046) μg/g(k=2)。

4 结论

本文从标准溶液配制、标准工作溶液配制、标准曲线拟合、样品称量、样品定容、重复性测试等方面对不确定度进行评定，依据《化妆品安全技术规范》(2015年版)测定化妆品中水杨酸含量时，不确定度的主要来源是样品定容、标准品配制过程、重复性测定，仪器等。