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生防细菌ML-3抗菌蛋白稳定性研究

2020-06-22李静舒赵佳

农业与技术 2020年11期
关键词:发酵液平板病原菌

李静舒 赵佳

摘 要:为确定ML-3表达的抗菌蛋白在不同外部环境下的稳定性,本研究采用不同温度、pH、紫外光照時间、金属离子、蛋白酶处理,对ML-3抗菌蛋白抑菌性进行研究。结果表明:该抗菌蛋白在低于60℃、pH5~8、紫外光照24h下可以保持较高抑菌活性;对Cu2+和Mg2+敏感,对Na+、K+、Zn2+和Fe2+不敏感;对胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感,对蛋白酶K不敏感。提示ML-3抗菌蛋白在田间生物防治中具有一定应用潜力。

关键词:ML-3抗菌蛋白;温度;pH;紫外光照;金属离子;蛋白酶

中图分类号:S-3

文献标识码:A

细菌侵染类型的病害具有种类多、分布广、危害重的特点,严重制约了农业发展。马铃薯早疫病(Alternarin solani Sorauer)是制约马铃薯正常发育的真菌病害之一,其是由链格孢属的茄链格孢菌(Alternaria solani)引起,主要发生在植株的叶部和块茎,危害性仅次于晚疫病[1]。这种病害高发于马铃薯主要种植区,严重影响生产,降低马铃薯的产量和质量,还有可能导致大范围内病害流行。目前农业上主要采用化学农药来防治菌物病害[2]。但是,这种以化学性农药为主的密集型杀害方法,不仅会使病害对药剂产生抗药性,还会破坏农业生态系统,对人类健康造成影响[3],采用生物防治的方法来减少化学农药的投入是发展的趋势。

山西省农科院生物技术中心曾从马铃薯茎部分离筛选出了1株马铃薯早疫病拮抗菌株ML-3。本研究旨在确定ML-3表达的抗菌蛋白在不同外部环境下的稳定性,评价该抗菌蛋白在田间的适用可能性,进而为开发抗马铃薯早疫病的生物农药提供思路,为生物防治作物病害方面的应用奠定一定基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验菌株及培养基

1.1.1 实验菌株

ML-3拮抗菌株和马铃薯早疫病病原菌,由山西农业科学研究院保存和提供。

1.1.2 供试细菌培养基质

参照高振峰[4]的方法配制培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株ML-3的活化

菌株ML-3(-80℃冰箱冻存)解冻后,取50μL悬浮液,用接种环接种到新鲜配制的NA平板上,于30℃下恒温培养48h。

1.2.2 马铃薯早疫病病原菌活化

用接种环少量挑取马铃薯早疫病病原菌,接种到新配制的PDA平板上,于30℃下温箱恒温培养3d;待菌落直径长到约1.5cm左右时,挑取菌丝转接到新配制PDA平板上,于30℃下温箱恒温培养7d,为后续实验准备。

1.2.3 菌株ML-3的发酵液制备

将活化培养48h后的菌株ML-3置于超净台内,用接种环挑取一环,接种到装有100mL新配制NB培养液的三角瓶中,于30℃下、振速180r/min培养72h后,终止发酵,得到菌株ML-3的种子发酵液。取发酵液接种到新配制NB培养液中,接种比例为1%(V/V)。于30℃下、振速180r/min培养72h后,终止发酵。于4℃下、转速10000r/min离心10min,最后将上清液通过微孔滤膜进行除菌,用于蛋白提取。

1.2.4 菌株ML-3抗菌蛋白的硫酸铵盐析提取

根据吴艳[5]的方法提取抗菌蛋白,量取1000mL菌株ML-3发酵液到量杯中,冷水浴中加入饱和度为80%的硫酸铵,并保持搅拌,待固体溶解后,放置于4℃冰箱中进行沉淀。12h后,于转速10000r/min下离心10min,倒掉上清液。向沉淀物中加入10mL的Tris-HCL(0.01mol/L,pH8.4)缓冲液充分溶解。溶解后将溶解物装入透析袋中,在Tris-HCL(0.01mol/L,pH8.4)缓冲液中透析,每过4h更换1次缓冲液,透析72h。透析完成后,于真空冷冻干燥机中制成冻干蛋白粉,保存于-20℃冰箱备用。

1.2.5 ML-3抗菌蛋白抑菌活性检测

根据采俊香、李月梅[6]的菌丝生长速率法测定抑菌率。配制浓度为0.1g/L的ML-3抗菌蛋白液,按照1∶9的比例(V∶V)将蛋白液和液体PDA培养基混合,注意不要产生气泡,倒入灭菌培养皿中,制备含药平板,等待凝固。在活化后的马铃薯早疫病原真菌平板上用灭菌打孔器取直径为5mm的菌饼,接种到凝固后的含药平板中心位置,将Tris-HCl(0.01mol/L,pH8.4)设置为对照物,于30℃下恒温培养3d,重复实验3次。

抑菌率计算公式:

抑菌率(%)=D2-D3D1-D3×100%

式中,D1为对照物处理病原菌菌落直径(mm),D2为抗菌蛋白处理病原菌菌落直径(mm),D3为菌饼直径(mm)。

1.2.6 ML-3抗菌蛋白稳定性分析

1.2.6.1 温度对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

取8支10mL的灭菌离心管,分别加入5mL抗菌蛋白液,按照温度梯度为22℃(室温)、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃在水浴锅中处理20min,冷却至室温,进行抑菌活性测定,方法同1.2.5,重复实验3次。

1.2.6.2 酸碱度对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

取8支10mL的灭菌离心管,分别加入5mL抗菌蛋白液,用HCl和NaOH(C均为1mol/L)分别调整pH至4.0,5.0,6.0,7.0(原始),8.0,9.0,10.0,11.0,室温静置30min,全部调回原始pH,以未经处理的抗菌蛋白液为对照,进行抑菌活性测定,方法同1.2.5,重复实验3次。

1.2.6.3 紫外光照对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

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